2光子レーザー軸索切開術:ゼブラフィッシュ胚の軸索を損傷し、軸索の回復を観察する方法

要約

出典:O'Brien G. S., et al. 生きたゼブラフィッシュ胚における2光子軸切開術とタイムラプス共焦点イメージング。J. Vis. Exp.(2009年)。

このビデオでは、2光子レーザー軸切開術を使用してゼブラフィッシュの胚の軸索を損傷し、損傷からの軸索の回復を観察する方法を説明しています。

プロトコル

1: カメレオンTi-サファイアレーザーを備えた特注の2光子顕微鏡を使用した2光子軸断術

1. イメージングの準備をします。マウントされた胚を顕微鏡下のスライドホルダーに置きます。40倍(0.8 NA)の水対物レンズを持つ1つの胚に焦点を当てます。レーザーをオンにします。私たちは、以下のパラメータを用いてGFPを発現するニューロンを再現性よく可視化し、損傷を与えることができました。損傷を与えないパワーで軸索を視覚化するには、レーザーを波長910ナノメートル(nm)と出力30ミリワットに設定します(記載されているmWはサンプルのパワー量です)。イメージングソフトウェアを開きます。私たちは、Karel Svobodaの研究室で開発されたScanImageソフトウェアを使用しています。
2. フォーカスを押して、2光子レーザーで胚をスキャンし、軸索切除したい軸索を特定し、この軸索の画像をキャプチャします。最初と最後の Z 位置をマークし、画像を取得して、Z スタックの最大投影を行います。
3. 軸索を切断する軸索の枝を70倍に拡大し、スキャンを停止します。サンプルのmWを180mWの損傷力まで増やし、レーザーで1回のスキャンを実行します。これを行うには、Zスライスの数を1に設定し、「グラブ」を押します。これは軸索を切断するのに十分なはずです。この手順を顕微鏡と実験目標に最適化する方法については、ディスカッションを参照してください。
4. ズームアウトし、電力を 30 mW に下げて画像を撮影します。

2: Zeiss 510 共焦点/2光子顕微鏡での 2 光子軸切開術

1. マウントされた胚をステージに置き、25倍水対物レンズまたはその他の適切な対物レンズを使用して焦点を合わせます。
2. マルチトラック設定で2光子(910 nm)レーザーとアルゴンレーザー(488 nm)をオンにすると、一方から他方に切り替えることができます。GFPの検出には両方のレーザーが使用されますが、2つの光子の発光は赤で、アルゴンレーザーの発光は緑で視覚化され、2つを区別します。
3. アルゴンレーザーを使用して、損傷する軸索を特定します。Z設定の下で、最初と最後の光学セクションをマークします。共焦点画像を撮影し、Zスタックの最大投影を作成します。
4. 損傷する軸索の領域を選択し、この領域に焦点を合わせます。アルゴンレーザーをオフにし、2光子レーザーをオンにします。2光子で試料をレーザー強度~9%の透過率でスキャンし、軸索にまだ焦点が合っていることを確認します。
5. 「停止」ボタンをクリックして、切り抜きツールが利用可能になるようにします。切り抜きを使用して、対象領域を拡大します。通常、~70倍にズームします(ズームは「モード」タブで確認できます)。「チャネル」タブで、2光子の強度を~9%の透過率から15〜20%の透過率に変更します。
6. 軸索を切断するには、「高速XY」ボタンを約1秒間アクティブにしてから、停止ボタンを押して過剰な損傷を避けます。手順が機能した場合、軸索は散在する破片と見なす必要があります。
7. 軸索が損傷したことを確認するには、488 nmアルゴンレーザーに切り替え、別の共焦点画像を撮影して、最大の投影を作成します。