ゼブラフィッシュのオプトジェネティクス:幼虫の行動反応を研究するための遺伝子組み換え体性感覚ニューロンの活性化

要約

出典:Palanca A. M. S., et al.ChEF-tdTomatoを用いたゼブラフィッシュ体性感覚ニューロンの光遺伝学的活性化。J. Vis. Exp.(2013年)。

このビデオでは、遺伝子組み換え体性感覚ニューロンを活性化し、誘発された行動反応を高速ビデオカメラで記録する光遺伝学的手法について説明しています。

プロトコル

1. 行動実験のための幼虫のマウント

1. ddH2Oに1.5%の低メルトアガロースを添加し、固化を防ぐために42°Cのヒートブロックに保管します。
2. ガラス製のパスツールピペットを使用して、事前にスクリーニングした幼虫の1つを、青色/胚水ができるだけ少ない1.5%低融点アガロースのチューブに移します。
3. アガロースの滴の中の幼虫を小さなペトリ皿に移します。
4. 解剖顕微鏡の下で、幼虫を背側に置きます。
5. アガロースが固まったら、細いカミソリの刃(#11メス)でアガロースを切り取り、幼虫全体に寒天のくさびを残します。
6. 卵黄の両側に斜めに2つの切り込みを入れ、幼虫を傷つけないように注意してください。
7. アガロースの周囲を胚/青い水で満たします。
8. アガロースを幼虫の幹と尾から引き離します(図1)。

>2 .ハイスピードカメラとイメージングソフトウェアの準備

1. ハイスピードカメラを解剖スコープに取り付けます。
2. カメラをコンピューターに接続します。
3. コンピュータの電源を入れます。
4. ハイスピードカメラの電源を入れます。
5. オープンビデオ/イメージングソフトウェア(AOSイメージングソフトウェアを使用しており、ここで使用手順を説明しますが、他のイメージングソフトウェアも同様に許容されます)。
6. それに応じてカメラ設定を調整します(つまり、1,000フレーム/秒(fps)、50%トリガーバッファ、またはその他の優先設定)。
7. 録音を開始します。

3. 473 nmレーザーを使用して単一ニューロンを活性化する

1. 刺激装置、レーザー、光ケーブルを取り付けます。
2. 刺激装置の電源を入れます。
3. 刺激装置を最大5ボルト、パルス幅5ミリ秒に設定します。
4. メーカーの指示に従ってレーザーをオンにします。
5. 解剖顕微鏡を使用して、ChEF-tdTomatoが発現するニューロンの細胞体の近くに光ケーブルの先端を配置します(図1)。
6. 青色光のパルスを照射して感覚ニューロンを活性化します。
毎
7. 秒500または1,000フレームに設定されたハイスピードカメラを使用して動作を記録します。
8. 必要に応じて実験を繰り返し、各活性化の間に1分間待って、慣れを避けます。(各ニューロンに対して最低3つの応答を記録します)。
9. 幼虫を放すには、動物を傷つけないように注意しながら、鉗子でアガロースをこじ開けます。この動物はさらに発達させることができ、行動の発達を特徴付けるために、この手順を古い段階で繰り返すことができます。また、以下で説明するように、胚を再マウントして活性化細胞の高解像度共焦点イメージングを行い、挙動を細胞構造と相関させることもできます。
10. 幼虫を新鮮な青色/胚水で培養プレートに移します。24ウェルプレートを使用して、個々の幼虫を追跡します。

結果

図 1.マウントされたゼブラフィッシュの幼生と、幼生の触覚反応に関与する代表的なニューロンの図。ゼブラフィッシュの幼生は、1.5%低融点のアガロース(幼生の吻側部分を囲む破線で表される)に部分的にマウントされました。三叉神経細胞(頭の中)とRohon-Beard神経細胞(体幹内)は赤で描かれています。Mauthner細胞は、幼虫の破線で囲まれています。光ケーブル(白)は、RBニューロン細胞本体の上に配置されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
低メルトアガロース	シグマ	A9045の	または同等のもの
シャーレ(100x15 mm)	任意	任意
非滅菌メスブレード	ファイン・サイエンティフィック・ツールズ(株)	10011-00	または同等のもの
ブルー/胚水			10 L ddH2O 0.6 g インスタント オーシャン 6 滴 メチレン ブルー
ハイスピードカメラ	AOSテクノロジーズ株式会社	X-PRI(130025-10)	または同等のもの
ガラスパスツールピペット	漁夫	1367820Bの	または同等品(直径10-15 mm)
473nmポータブルレーザー	クリスタルレーザー	CL-473-050	またはそれ以上の電力、TTLオプション付き
S48刺激装置	アストロメッド株式会社 グラスインストゥルメント事業部	S48K	または同等のもの
トリカイン	シグマ	A5040 (英語)
200μm光ファイバー	トールラボ	AFS200/220Y-カスタム	パッチコード、長さ:3m、端部A:FC/PC、端部B:FC/PC、ジャケット:FT030
50μm光ファイバー	トールラボ	AFS50/125Y-カスタム	パッチコード、長さ:3m、端部A:FC/PC、端部B:FC/PC、ジャケット:FT030
24種類の培養プレート	ジェネシー	25から102	または同等のもの