眼の水晶体解剖:ゼブラフィッシュの水晶体の形態を観察する技術

要約

出典:Vorontsova I. et al, ゼブラフィッシュの水頭核局在と縫合完全性の評価。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、成体と幼虫のゼブラフィッシュのレンズを解剖して、皮質レンズの形態とレンズ縫合糸の構造的完全性を分析するために開発されたプロトコルについて説明しています。

プロトコル

1. ゼブラフィッシュの幼生と成魚のレンズの解剖

1. 6 dpfの幼生から成魚まで、触れても反応しないが強い心拍を示すまでトリカインで魚を麻酔します。ステージングのために、Schilling(2002)に従って魚の標準の長さを測定します。
2. すぐにマイクロ解剖ハサミを使用して眼を切除し、PBSの解剖皿に入れます(図1は成人の眼について示されています)。
   1. レンズ解剖用のシリコンを充填したカスタム35mmディッシュを作成します。シリコーンが固まったら、解剖中に成人の目/レンズを固定するために、直径約2〜3 mm、深さ0.5mmのディボットを切除します。
3. 成体のゼブラフィッシュレンズの解剖
   1. PBSで満たされた皿のディボットの後面を上にして大人の目を置きます。視神経乳頭を通して<45°の角度で鉗子を挿入することにより、目を固定します。レンズに傷をつけたり、圧縮したりしないように注意してください。網膜と強膜を通して、視神経乳頭から繊毛帯まで解剖ハサミで2〜3本の放射状切開を行います。
   2. 網膜と強膜を花びらのように剥がし、角膜側を上にして目を反転させます。はさみの平らな面で強膜と角膜を操作し、網膜と付着した組織を鉗子で引き離しながら、レンズを間接的に固定します。レンズから余分な組織を慎重にトリミングします.
      手記：一貫して健康なレンズを得るためには、慎重に解剖することが重要です。
4. ゼブラフィッシュの幼虫のレンズの解剖
   1. PBSで満たされたシリコン皿の平らな部分に幼虫の目の後面を上にして置き、鋭利なタングステン針を使用して網膜と強膜を放射状に切り込み、別のタングステン針または鉗子で目を固定します
      手記： レンズを傷つけないように注意してください。
      1. 長さ2cmの0.1mmタングステン線の先端を10%(w / v)NaOHに吊り下げ、低電圧交流14を印加することにより、電解的に鋭利にします。ブンゼンバーナーを使用してガラスの端を溶かし、針をパスツールピペットに固定します.
         手記：別の精密解剖ツールも使用できます.
         注意：NaOHは腐食性です。
   2. 針の鈍い面で解離した目からレンズをそっとすくい取り、付着したティッシュを慎重に引き抜きます。

結果

図1:ゼブラフィッシュのレンズ解剖。(A)麻酔をかけた魚から目を解剖し、後面を上にして配置します(B)。(C)視神経乳頭(od)を介して鉗子で眼を固定し、視神経乳頭から小帯までの網膜と強膜に2〜3本の放射状切開を行います。(D)フラップを折りたたむと、レンズが現れます。(E)目を回転させて角膜を上に向け、角膜を介して間接的にレンズを固定し、強膜網膜を引き離します。(F)レンズから残りの網膜と毛様体帯/小帯を切り取ります

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	フィッシャーサイエンティフィック	BP399
ガラス底面マイクロウェルディッシュ(35mmシャーレ、14mmマイクロウェル、#1.5カバーガラス)	MatTek株式会社	P35G-1.5-14-C
デュモン#5鉗子	デュモン&フィス		鉗子を鋭く保つ
バンナスマイクロ解剖はさみ	テッド・ペラ・インク	1346	シャープ/シャープなストレートチップ
共焦点顕微鏡	ニコン		エクリプスTi-E
水酸化ナトリウムビーズ	フィッシャーサイエンティフィック	S612-3	注意 - 目や皮膚、標的臓器に腐食性/刺激性 - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 呼吸器系, 金属に腐食性
使い捨てパスツールガラスピペット	フィッシャーブランド	13-678-20A

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