全細胞パッチクランプ電気生理学:ニューロンの電気的特性を研究する方法

要約

出典:Roy, B., et al. 胚性ゼブラフィッシュMauthner細胞からのパッチクランプ記録。J. Vis. Exp.(2013年)。

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚におけるマウトナーニューロンおよび他の細網脊髄細胞の電気的特性を研究する方法である、全細胞パッチクランプ電気生理学と呼ばれる技術を説明しています。

プロトコル

1. パッチクランプ記録(全細胞モード)

1. すべての記録は、全細胞パッチクランプモードで実行されます。記録チャンバーは、電気生理学セットアップで顕微鏡ステージ上に配置されます。当社のステージは固定されており、直立したパッチクランプ顕微鏡は可動式顕微鏡プラットフォームまたは顕微鏡トランスレータにボルトで固定されています。
2. パッチクランプピペットは水平プーラー(P-97;サッターインスツルメンツ株式会社WPIから得られた薄肉のホウケイ酸ガラスから。ピペットチップの直径は、ファイヤーポリッシュ後0.2〜0.4μmのオーダーで、滑らかなエッジに、シャンクテーパーの長さは~4mmです。
3. ピペットを電気生理学セットアップのアンプヘッドステージに取り付けます。ヘッドステージを水平軸に対して約45°の角度に保つことが重要です。これにより、Mauthnerセルへの高抵抗シールの形成に適したピペットの進入角度が確保されます。
4. 浴液に入る直前に、ピペットに少量の陽圧を加えて、チップが汚れる可能性を減らします。mEPSCを記録する場合、バスソリューションには、活動電位をブロックするための1 μM TTX、グリシン受容体をブロックするための5 μMストリキニーネ、GABAA受容体をブロックするための10 μMビキュクリンまたは100 μMピクロトキシンが含まれます。mIPSCを記録する場合、浴液には1 μM TTX、キヌレン酸、および目的の受容体活性に応じてビククリンまたはストリキニーネが含まれます。
5. ピペット内で少量の陽圧でM細胞に近づきます。陽圧は細胞を左右に穏やかに押し、細胞のすぐ上に配置されると、細胞膜上に小さなくぼみを形成します。ピペットを数秒間そのままにして細胞表面を優しく洗浄し、ピペットとメンブレンとの間に強力なシールを形成できるようにします。ピペット内の正圧を解放すると、シールが開始され、少量の負圧と負のピペット電位が組み合わさると、数秒以内にギガΩシールが形成されます。
6. アンプの保持電位を-60mVに変更します。一連の短い吸引パルスで細胞膜を破裂させます。膜電位を即座に記録し、キャパシタンスのアーチファクトを最小限に抑えます。セルの静電容量(Cm)とアクセス(直列)抵抗(Ra)を70〜85%補正します。Raは30秒から1分ごとに定期的に監視し、20%以上の変化がある場合は実験を中止する必要があります。
7. 実験が終了し、十分なデータが取得されたら、一対の鉗子で後脳を取り除くことにより、準備を犠牲にします。この時点で、データ分析を開始できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ピペットプーラー	サッターインスツルメンツ株式会社	P-97
アップライトパッチクランプ顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	DMLFSAの
増幅器	分子デバイス	200バーツ
マイクロマニピュレーター	シスキユー株式会社	MX7500