筋肉内(IM)注射:成魚の背側筋への化合物送達

要約

出典:Myllymäki, H., et al.DNAベースのワクチンの前臨床スクリーニングのための成体ゼブラフィッシュの予防接種。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、成魚の背側筋に化合物を送達するための筋肉内注射の技術について説明しています。

プロトコル

1. DNAワクチンの注射とエレクトロポレーション

1. このプロトコルに従った予防接種には、生後6ヶ月から12ヶ月の健康な成魚のゼブラフィッシュを使用してください。魚を14/10時間の明暗サイクルのフロースルーシステムに保ち、水1リットルあたり最大7匹の魚
を飼います。
2. 魚を麻酔するために、水槽水に0.02%3-アミノ安息香酸エチルエステル(トリカイン)溶液(pH 7)を準備します。10cmのシャーレなどを使用してください。
3. 5Lのビーカーに3Lのきれいなシステム水を満たして、回収タンクを準備します。
4. ワクチン接種中に魚を固定位置に保つために、ワクチン接種パッドを準備します。厚さ2〜3cmのスポンジに5×7cmײ枚取ります。メスの刃または鋭利なハサミでスポンジに溝を切ります.
   手記：同じワクチン接種パッドを複数の実験に使用できます。実験の合間にスポンジを70%エチルアルコールに浸して消毒し、乾燥させます。
5. スポンジをシステムの水に完全に浸し、スポンジをシャーレにセットします。
6. ワクチン接種の24時間前に魚を絶食します。
7. 1匹のゼブラフィッシュを0.02%のトリカインを含むシャーレに載せて麻酔します。魚が触覚刺激に反応しなくなり、えらの動きがなくなるまで待ちます。一度に1匹の魚に麻酔をかけます。
8. プラスチックのスプーンを使用して、麻酔をかけたゼブラフィッシュを濡れたスポンジに移し、魚の腹側を下にして溝に置きます。正しい位置で、魚の頭と体の大部分が溝の内側にあり、背びれと尾が溝から突き出ていることを確認してください。
9. 顕微鏡下で、マイクロマニピュレーターのx軸とy軸の微調整ホイールを使用して、ゼブラフィッシュの背筋に近い約45°の角度で針を慎重に配置します。
10. 背びれの前にある鱗のない小さな場所を見つけ、針を押すのに力が要求されない場所を見つけます。抵抗を感じる場合は、隣接する場所を試してください。背骨、背びれ、または鱗を傷つけないでください.
    手記：押しているうちに針が曲がってしまう場合は、針を切って少し短くしてください。
11. フットスイッチを使用して、ワクチン溶液を筋肉に徐々に注入します。顕微鏡で注射を観察します:フェノールレッドが筋肉組織に入ると見えます。必要に応じてパルスの持続時間を調整します。
    手記：または、空気圧ポンプのフロントパネルにあるパルスイニシエーターボタンを使用して注入します。ただし、リモートフットスイッチを使用すると、もう一方の手で10回転ダイヤルホイールでパルス長を調整できます。溶液を急ぎすぎると、組織が過度に損傷する可能性があるため、避けてください。空気を注入しないように注意してください。
12. 注射後すぐに魚をエレクトロポレーションします。魚がまだ麻酔下にあることを確認してください。魚をスポンジに置き、ピンセットタイプの電極の間に魚をセットして、電極が注入部位の両側に配置されるようにします。電極ピンセットをきつく押しすぎず、両方の電極を魚に接触させてください。
    1. エレクトロポレーターのスタートボタンを押すと、40 V、50 msのパルスが6回発生します。
    2. 魚をそっと回収タンクに移します。
    3. 各エレクトロポレーション後に電極を70%エタノールでスワイプして清掃します.
       手記：ワクチン接種後の魚の健康状態を注意深く監視してください。不快感の兆候(麻酔からの回復が遅い、異常な水泳、あえぎ)を示している魚は、0.04%トリカインで安楽死させます。回復後、魚をフロースルーユニットに移し、通常どおり餌をやります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フェノールレッドナトリウム塩	シグマ・アルドリッチ	114537-5グラム
トリカイン(エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩)	シグマ	A5040-100グラム	anestesiaと安楽死の解決策
ピンセット電極(7 mm)キット	BTXハーバード装置	BTX 450165	ピンセット型電極
アルミノケイ酸塩キャピラリー	ハーバードの装置	〒30-0108
マイクロマニピュレーター	成茂	MA-153
顕微鏡	オリンポス	ZS61
ECMエレクトロスクエアポレーター	BTXハーバード装置	BTX ECM 830
プラスチックスプーン
スポンジ
発泡スチロールの作業台