胚マイクロインジェクション:ゼブラフィッシュの卵黄に化合物を送達する技術

要約

出典:Sorlien, E. L., et al.モデルシステムDanio rerioにおけるCRISPR/Cas9生成遺伝子ノックアウトの効率的な生産と同定。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、ゼブラフィッシュの卵黄嚢に化合物を送達するための胚マイクロインジェクションの技術について説明しています。

プロトコル

1. ゼブラフィッシュ胚へのCRISPR成分のマイクロインジェクション

1. 注入の前夜に、仕切りが設置された繁殖タンクに希望のオスとメス(通常はメス2匹とオス1匹または2匹)の数を入れて、繁殖タンクを設置します。
2. 1x E3培地(材料表を参照)に1.5%アガロースを入れたマイクロインジェクションプレートを、0.01%メチレンブルー(殺菌剤)を含む10cmのシャーレに35mLを注ぎ、プラスチック型を静かに置き、溶液中にくさび形のトラフを作り、型を軽くたたいて気泡を取り除きます。
3. アガロースを固め、少量の培地で皿を保管し、パラフィンフィルムで包んでプレートが4°Cで乾燥するのを防ぎます
   手記：インジェクションプレートは、ウェルが変形したり乾燥したり、プレートにカビが生え始めるまで、数週間再利用できます。
4. 注入日の朝、精製したsgRNAとCas9タンパク質を氷上で解凍しました。RNaseの汚染を防ぐために、すべての材料を手袋で取り扱い、RNaseフリーのチップとチューブを使用することを忘れないでください。
5. Cas9タンパク質とsgRNAをCas9:sgRNAの比率2:1で組み合わせて5 μLの注入溶液を生成し、最終濃度400 pg/nLのCas9タンパク質と200 pg/nLのsgRNAを得ます。Cas9/sgRNA溶液を室温で5分間インキュベートし、Cas9とsgRNAがリボ核タンパク質複合体を形成するようにします。0.5 μL の 2.5% wt/vol フェノール赤色溶液 (材料表を参照) と RNase フリー水を加えて、最終容量 5 μL.
   手記：溶液のイオン強度はCas9/sgRNA複合体の溶解度に影響を与えることが示されているため、KClの添加により、低インデル形成を示すsgRNAの切断効率が向上する可能性があります。
6. マイクロピペットプーラーを使用して1.0mmのガラスキャピラリーを引っ張って注射針を作ります。新しいかみそりの刃または鉗子を使用して作りたての針の先端をカットし、絨毛膜と卵黄嚢を簡単に突き刺す角度の付いた開口部を取得します。
7. マイクロインジェクターに取り付けられたマイクロマニピュレーターに針を置き、空気源をオンにします。特定の装置について決定されたキャリブレーションに適した倍率を使用して光学顕微鏡下で、針が鉱油で満たされたペトリ皿に1nLの溶液を一貫して排出するまで注入圧力を調整します
   手記：針の品質は非常に重要です。針を作り、胚の卵黄嚢に注入する練習をして、このスキルが習得されるまで、さらなる実験を試みます。
8. 仕切りを取り外し、魚が約15分間繁殖するのを待ちます
   手記：繁殖時間が長いほど、より多くの胚が生産されますが、Cas9切断が早期に発生し、遺伝的モザイク現象を減らす可能性を最大化するために、胚が1細胞段階にある間に注入を完了する必要があります。胚は後の段階(2〜4細胞段階)で注入できますが、これにより修飾対立遺伝子の生殖細胞伝達率が低下する可能性があります。
9. ストレーナーを使用して卵を収集し、10%メチレンブルーの1x E3培地を使用して0.0001cmのシャーレですすいでください。光学顕微鏡で卵子の健康状態を調べ、未受精卵や破片を取り除きます。
10. 10〜15個の胚を未注入のコントロールとして、ラベル付きの別のシャーレに置きておきます。
11. トランスファーピペットを使用して、室温に温めた注入プレートに卵をそっと並べます。
12. 2.5倍の倍率で解剖顕微鏡下で、各胚の卵黄嚢に溶液1nLを注入して、合計400 pgのCas9タンパク質と200 pgのsgRNAを注入します
    手記：必要に応じて切断を増やすには、注射液中のCas9タンパク質の最終濃度を800 pg/nLに、sgRNAの最終濃度を400 pg/nLに増やします。しかし、これにより、オフターゲット切断が増加したり、胚の健康が損なわれたりする可能性があります。切断効率は、セルに直接注入することによっても向上させることができます。ただし、卵黄袋への注入は技術的にそれほど要求が厳しくなく、生殖細胞系伝達が高い魚を生産するのに十分な切断が得られます(修飾対立遺伝子を含む子孫の>70%)。
13. 注入した胚を適切に標識したペトリ皿に戻し、メチレンブルーの入った1x E3培地で覆い、28°Cに設定した胚インキュベーターに入れます。
14. 受精後24時間(hpf)で、注入された胚の健康状態を検査し、死亡した個体または異常に発達している個体を取り除き、培地を交換します(図1を参照)。注射していないコントロールに対する生存率を確認します.
    手記：非必須遺伝子を標的とする場合、注射されていないコントロールと比較して、致死率は10%未満と予想されます。ガイド注射を受けた集団で、注射されていない対照群と比較して致死率の上昇が観察された場合、それは標的遺伝子が発生に不可欠であるか、またはオフターゲット効果が発生の失敗につながっていることを示している可能性があります。注入されるCRISPR試薬の量を減らすことが必要な場合や、オフターゲット効果を低減した新しいsgRNAの生成が必要になるかもしれません。
15. 胚をインキュベーターに戻し、胚の健康を維持するために培地を毎日交換しながら、胚を72 hpfまで成長させ続けます。

結果

図1:24hpf注入された胚の健康状態の比較。24 hpfに発達した生きた胚(A)は、発生が中止された胚(B)と簡単に区別できます。(B)に似ている胚、または脊椎の湾曲や頭と目の発達の変化など、(A)に特徴が大幅に変化している胚は、皿から取り除く必要があります

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RNaseフリー水	どんなブランドでも		ガイドRNAの合成。サーモ < BR /> フィッシャーとキアゲンはどちらもキャリー 適切な水。
E3胚培地	自社製		胚を育てるための培地と インジェクションプレート. を作る レシピ:http://cshprotocols.cshlp.org/ コンテンツ/2011/10/pdb.rec66449
メチレンブルー	シグマ・アルドリッチ	M9140	胚の真菌増殖を防ぐために1x E3培地に添加
ペトリ皿	サーモフィッシャー	FB0875711Z	胚の保存、キャスト注入プレート
アガロース	デンビル	CA3510-8	キャスティングインジェクションプレート、アガロースゲル。
マイクロインectionモールド	適応科学ツール	TU-1	注入中に胚を保持するウェルを作成するため
フェノールレッド	シグマ・アルドリッチ	P0290	注射の可視化用色素
鉱油	シグマ・アルドリッチ	M5904-5ミリリットル	針の注入量を校正します。
トランスファーピペット	どんなブランドでも		動く胚
カミソリの刃	サーモフィッシャー	11295から10	カットインジェクションニードル、テールクリッピング成魚。
孵卵器			胚を28.5°Cに維持します。
垂直ピペットプーラー	デビッド・コップフ・インスツルメンツ	700°C	注射用の針を属します。追加の針の引き方: http:// cshprotocols.cshlp.org/ 内容/2006/7/pdb.prot4651.long
キャピラリーチューブ	サッターインストゥルメント	BF100-58-10	注射用の針を属します。
マイクロローダーのヒント	エッペンドルフ	930001007	注射針に溶液をロード
マイクロインジェクター	世界の精密機器	PV820	胚を注入します。
解剖顕微鏡	ライカ		胚を注入します。
マイクロ波	どんなブランドでも		キャスティングインジェクションプレート、アガロースゲル。
規模	どんなブランドでも		キャスティングインジェクションプレート、アガロースゲル。
手袋	どんなブランドでも		プロトコルのすべての側面について。
N2	どんなブランドでも		胚注入のために毛細血管から液体を排出する
PCRストリップチューブ	どんなブランドでも		プロトコルのすべての側面について。
200 μL チップ	どんなブランドでも		プロトコルのすべての側面について。
10 μLのヒント	どんなブランドでも		プロトコルのすべての側面について。
マイクロピペット	どんなブランドでも		プロトコルのすべての側面について。