ゼブラフィッシュ患者由来異種移植片(zPDX):がんモデル

要約

出典:Wang L. et al., ゼブラフィッシュ幼生を宿主として比較薬物評価のための膵臓癌の患者由来の不均一異種移植モデル。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、ゼブラフィッシュ患者由来の異種移植モデルを作成する手法について説明しています。サンプルプロトコルでは、膵臓腫瘍異種移植モデルに対する薬剤ゲムシタビンとナビトクラクスの効率を評価します。

プロトコル

1. ゼブラフィッシュへの混合細胞懸濁液の注入

1. E3水に10倍トリカイン溶液を加えてゼブラフィッシュの幼生に麻酔をかけ、幼生(ステップ2.3から)を修飾E3(1 g / Lグルコースと5 mmol / L L-グルタミンを含むE3)で満たされた注入プレートに移します。.
2. 混合細胞懸濁液25μLをマイクロキャピラリー針に充填し、針をマイクロインジェクションマニピュレーターに挿入します。
3. 射出圧力と時間を設定します。50-80細胞(~8 nL)を48 hpfゼブラフィッシュの卵黄嚢に注入します。

2. ゼブラフィッシュの養殖(zPDXモデル)

1. 異種移植後のゼブラフィッシュの幼生を40 mLの混合溶液(1 g/Lグルコースと5 mmol/L L-グルタミンを含むE3溶液)に32°Cで移します。

3. ゼブラフィッシュ異種への薬物投与と腫瘍細胞/線維芽細胞の生存能力の評価

1. ゲムシタビン/navitoclaxの最適濃度の決定。
   1. 野生型ゼブラフィッシュの胚10個を48 hpfで12ウェルプレートの各ウェルに入れます。
   2. 各ウェルに異なる濃度のゲムシタビンまたはnavitoclaxを加え、32°Cで2日間インキュベートします。
   3. 2日後、ゼブラフィッシュの幼生が重大な奇形や異常な行動を示さず、作業濃度がMTD未満に設定されているゲムシタビンとナビトクラクスの最大耐性投与量(MTD)を計算します。
2. ゲムシタビン/ナビトクラクスによるzPDXモデルの治療。
   1. 10匹の異種移植された幼虫を12ウェルプレートの各ウェルに入れます。
   2. 幼虫を4つのグループに分け、0.1%DMSOを含むE3で対照群を処理し、他のグループを5μg/mLゲムシタビンおよび/または50μMのnavitoclaxで処理し、32°Cで2日間インキュベートします。
3. zPDXモデルにおける細胞生存能力と細胞組成の評価。
   1. 治療後に異種移植された幼虫を麻酔し、それらを3%メチルセルロースに入れます。.
   2. 蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、側面図から幼虫をメイジします。
   3. ImageJおよびGraphPadソフトウェアを使用して、赤と緑の蛍光シグナルの強度を定量化します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
L-グルタミン	ギブコ	21051024
ゲムシタビン	ジェムザン
メチルセルロース	シグマ	M0262
ナビトクラックス(ABT-263)	セレック	S1001	Bcl-xL阻害剤
備品
マイクロインジェクター	成茂
共焦点顕微鏡	ライカ	SP8	0.00

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