心臓解剖:ゼブラフィッシュの心臓発達を観察する方法

要約

出典:Singleman C. et al., 幼虫、幼体、成魚の心臓解剖、Danio rerio.J. Vis. Exp.(2011年)。

このビデオでは、心臓の発達、成熟、老化を研究するために、複数の発達段階でゼブラフィッシュから心臓を分離する技術について説明しています。

プロトコル

1. 魚の測定と解剖

1. 新鮮なPBSを半分入れたペトリ皿に1匹の魚を入れ、右側に置きます。
2. デジタルmmキャリパーを使用して、尾びれを含まない鼻から尾の付け根(尾柄)までの魚の長さを測定します(図1)。これが標準の長さ(SL)です。
3. 各魚には数字と文字の組み合わせを割り当てることができ、個々の魚とその結果として解剖された心臓を追跡して後で分析することができます。親株番号、固定年齢、SL測定値などのデータをスプレッドシートに入力し、これらのラベルに基づいて整理しました。
4. 解剖する前に、割り当てられた追跡番号でPCRチューブストリップを標識し、PBTまたはさらなる分析に適した他の溶液を充填します。
5. 魚の腹側を上にしてペトリ皿に置き、鉗子で頭を目と鰓の間に保持して体を安定させます(図1)。

小さい魚(12mm SL未満):

6. a)鋭い鉗子、またはピンホルダーのマイクロニードルを使用して、胸筋とひれを体から取り除き、心臓を明らかにします。解剖中の鉗子の絶え間ない動きは、魚を動かすPBT内の電流を引き起こす可能性があります。これは特に小さな魚にとって問題となるため、マイクロニードルを使用して胸筋とヒレを取り除き、体腔を開くことができます。
7. a)鉗子をそっと使用して、心房の下から空洞から心臓をすくい取ります。あるいは、一部の魚では、球根をそっと引き抜くことで心臓を取り除くことができ、心臓の残りの部分が後からついてくる場合があります。この手法を使用する場合は、アトリウムが損傷しやすいため、アトリウムの位置に注意してください。心臓に付属している余分な組織があれば、それは問題ありませんし、後でクリアすることができます。
8. a) 魚にTg(myl7:GFP)^twu34などの蛍光心マーカーが含まれている場合は、蛍光スコープを使用して解剖し、蛍光による心臓の除去を確認します(図2)。
9. a)心臓が空洞から取り出されたら、鉗子を使用して心臓を保持し、マイクロニードルを使用して余分な非心臓組織と心外膜を心臓の外側から取り除きます。

より大きな魚(12mm SL以上):

6. b) スプリングハンドルのマイクロハサミを使用して、深さ1mm未満の3つの切開を行います:1-鰓を横切って切開します 2-前腹で横切開 3-両方の切口を接続する腹側の矢状切開(図3)。
7. b)鋭い鉗子を使用して、胸筋と鰭を体から取り除き、体腔を開き、心膜の銀色の組織を明らかにします(図4A)。この心膜組織を取り外すと、心臓が見えてきます(図4B)。
8. b)マイクロハサミを使用して、心臓の上に位置する球根状動脈に接続されている動脈を切断します。この動脈が切断されたら、鉗子の先端を心房の下に置き、鉗子を使用して空洞から心臓をすくい取ります。心臓に付属している余分な組織があれば、それは問題なく、後で取り除くことができます。
9. b)心臓が空洞から取り除かれたら、2つの鉗子を使用して心臓を保持し、余分な組織を取り除くか、1対の鉗子を使用して心臓を保持し、マイクロニードルを使用して余分な非心臓組織を取り除きます。心外膜の内壁は、その黒い色素沈着によって明らかであり、必要に応じて組織を穏やかにこすることによって心臓の外側から取り除くことができます。

結果

図 1.鉗子で目と鰓の間に魚を持ちます。

図 2.ここに示されているTg(myl7:GFP)^twu34などの心臓特異的蛍光トランスジェニックマーカーは、小さな魚から解剖した心臓の視覚化に役立ちます。

図 3.胸筋と皮膚を取り除くための3つの切開: 1-鰓を横切ってカット 2-前腹の横切開...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
鉗子#55	ファインサイエンスツール	11295から51
マイクロハサミ	ファインサイエンスツール	15005-08
ピンホルダー	ファインサイエンスツール	26016-12
マイクロニードル	ファインサイエンスツール	10130-10
ペトリ皿	BDバイオサイエンス	351029