同所性注射:成体マウスへの組織特異的がん細胞の移植

要約

出典:勝田、E.、他マウス同所性転移性乳がんモデルを生成し、マウスの根治的乳房切除術を実施します。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオは、マウスモデルでの乳がんの同所性接種技術を示しています。この技術は、皮下注射または非外科的注射と比較して、腫瘍のサイズと形状のばらつきが少なく、高い腫瘍形成率を生み出します。

プロトコル

1. 細胞の調製(マウス10匹分)

>注:細胞の生存率の低下を避けるために、細胞は皿から切り離されてから1時間以内に接種されるべきです。具体的には、細胞懸濁液を皿から分離した後15分以内にゼラチン状タンパク質混合物に混合して、生存率を維持する必要があります。

1. ルシフェラーゼを発現するマウス乳腺癌細胞株である4T1-luc2細胞を、RPMI 1640培地で10% FBS含有、加湿インキュベーター、37°C、5% CO₂で培養します。
2. 10 mLの血清ピペットを使用して、10 cmのディッシュで接着性4T1-luc2細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。P1000ピペットを使用して0.25%トリプシン1 mLを添加し、サンプルを37°Cで5分間インキュベートします。次に、5 mLの血清学的ピペットを使用して4 mLの増殖培地(RPMI-1640と10% FBS)を添加し、細胞懸濁液を組織培養フード内の15 mLコニカルチューブに移します。細胞懸濁液を180 x gで5分間遠心分離します。
3. 上清を吸引し、細胞を2mLのPBSに再懸濁し、血球計算盤を用いて細胞をカウントします。
4. 2 x 10⁶ 4T1-luc2細胞を40 μLの冷PBS(pH 7.4、4°C)に組織培養フードで懸濁します。
5. 40 μL の細胞懸濁液を 360 μL のゼラチン状タンパク質混合物と 1.5 mL の微量遠心チューブで組織培養フードの氷上に混合します。
   注:最終濃度は1 x 10⁵/20 μL(1:9 PBS:ゼラチン状タンパク質混合物)です。同所モデル(乳房切除術なし)では、2週間以内に安楽死基準(腫瘍サイズ> 2 cm)に達するのを避けるために、最終濃度の1 x 10⁴/20μLを使用しました。

2. がん細胞接種

1. マウスが落ち着いて呼吸するまで(2〜3分)、2〜4%イソフルランと0.2L / minの酸素流でマウスを麻酔導入チャンバーに入れます。
2. マウスをつかみ、0.05 mg / kgのブプレノルフィンを肩に皮下注射します。.
3. つま先をつまんでも反応しないことで、適切な麻酔を確認します。マウスマスクの穴にマウスの鼻を挿入すると、2〜4%のイソフルランと2L/minの酸素流量をチャコールキャニスターユニットに取り付けた吸入麻酔が可能になります。
4. 実験用テープを使用してマウスの手足を拘束し、綿棒を使用してクロルヘキシジン、ヨウ素、および75%エタノールを使用して皮膚を滅菌します。
5. 滅菌マイクロダイセクションハサミを使用して胸壁の前壁の中央に5mmの皮膚切開を行い、切開部の横にある右側の皮膚を持ち上げ、ハサミを使用して胸壁から皮膚を剥がし、皮膚を反転させて右側の#2乳房脂肪パッドを露出させます。
6. 28.5Gの針が付いた1mLのインスリン注射器を使用して、傷口から直接見える状態で脂肪パッドに20μLのがん細胞懸濁液を慎重に注入します
   注:針は皮膚ではなく傷口を通過します。針を引き抜く前に、針を脂肪パッドに5秒間保持し続けてください。これにより、ゼラチン状タンパク質混合物が固まるのを待ちます。
7. 滅菌済みの5-0非吸収性縫合糸を使用して、縫合して皮膚の切開を閉じます。
8. 手術後、動物を清潔なケージに戻し、動物が回復して自由に動くようになるまで観察します。手術後24時間以内に動物が健康でないと思われる場合は、ブプレノルフィン(0.2 mg / kg)を投与します。
9. 手術の7日後に麻酔下で縫合糸を抜きます(ステップ2.1を参照)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マイクロ解剖はさみ	ロボズ	RS-5983	がん細胞の無菌化と乳房切除術に
5-0シルク縫合糸	ほら	774B ファックス
ロズウェルパーク記念館1640	ギブコ	11875093	細胞培養用
ウシ胎児血清	ギブコ	10437028	細胞培養用
トリプシン-EDTA(0.25%)	ギブコ	25200056	細胞培養用
ドライ滅菌剤(Germinator 500)	ブレインツリー・サイエンティフィック	ドイツ軍 5287-120V	がん細胞の無菌化と乳房切除術に
ニードルホルダー	ロボズ	RS-7830	がん細胞の無菌化と乳房切除術に
アドソン鉗子	ロボズ	RS-5233	がん細胞の無菌化と乳房切除術に
クリッパー	ヴァール	〒9908-717	がん細胞の無菌化と乳房切除術に
マトリゲル	コーニング	354234	がん細胞の無菌化に