直接相互作用による3D共培養:がん細胞と単球の共培養による相互作用の研究

要約

出典: Espinoza-Sánchez, et al. Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System. J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、乳がん細胞と単球の3D共培養について説明し、細胞外マトリックス抽出物(ECME)ベースの環境での相互作用を研究しています。この方法は、コラーゲンの分解、免疫細胞の動員、細胞浸潤などの特定の特徴を研究するのに役立ちます。

プロトコル

1. 3D 直接的な相互作用を持つ共文化

1. 細胞培養前にBrC細胞と単球を異なる蛍光色素で標識すると、mRNAおよびタンパク質発現の解析のために、培養後に各細胞系統を独立して選別できます。クマリンとローダミンの市販の誘導体は、生細胞の細胞膜を自由に通過します。ラベル付けの一般的なプロトコルは次のとおりです。
   1. 目的のBrC細胞の単層(25 cm²培養フラスコ中の2 × 10⁶細胞)を調製し、標準培地を蛍光色素の十分な予熱済み作業溶液(サプリメントなしで標準ベース培地中の蛍光色素の1:2,000)と交換します。加湿した5%_CO2環境で37°Cで30分間インキュベートします。染料溶液を吸引し、十分な1x PBSで穏やかにすすいでください。PBSを吸引し、標準培地を追加します。
   2. 0.05%トリプシンと0.48mM EDTAの溶液2 mLで細胞単層をトリプシン処理し、37°Cで5〜10分間、200 μLのFBSを添加してトリプシン化を停止し、7 mLの対応する培地をサプリメントなしで追加します。ピペッティングにより細胞を再懸濁します。10 μLのアリコートを使用して、ノイバウアーチャンバー内の細胞をカウントします。細胞カウント後、共培養プロトコルを続行します。
   3. 細胞を430 x gでRTで5分間ペレット化します(単球は懸濁液中で増殖するため、最初にこれを実行します)。上清を捨て、蛍光色素の予熱した作業溶液3 mL(サプリメントを含まない標準ベース培地中の蛍光色素1:2,000)で細胞を穏やかに再懸濁します。加湿した5%_CO2環境で37°Cで30分間インキュベートします。
   4. 細胞を再度ペレット化し、色素使用溶液を廃棄し、5〜7mLの1x PBSで穏やかに再懸濁します。もう一度ペレット状にし、PBSを廃棄し、細胞を5〜7mLの標準培地に再懸濁します。10 μLの細胞懸濁液を1アリコート取り、ノイバウアーチャンバー内の細胞をカウントします。細胞カウント後、共培養プロトコルを続行します。
2. 次のように共培養を設定します:ウェルの底に十分なECMEを広げて、4ウェルチャンバースライドシステムの各ウェルに均一な層を形成します。ウェルあたり5個×10個⁵個の標識BrC細胞を含む単一細胞懸濁液の20μLをプレートします。
3. 37°Cで15〜20分間インキュベートした後、80 μLアッセイ培地(60% ECMEを添加)に2.5 x 10⁵標識単球の懸濁液を加えます。
4. ECMEを37°Cで15〜20分間固化させます。
5. BrC細胞と単球培養培地の1:1ミックスを1 mL加えます。
6. 加湿した5%_CO2環境下で37°Cで共培養物を24時間、48時間、または5日間インキュベートし、異なる時点での変化を追跡します。
7. ECMタンパク質を分解して、培養物から細胞を回収します。培地を吸引して廃棄し、0.1%トリプシンと0.25%EDTAを含む1x PBS0.5 mLを加え、37°Cで3時間インキュベートします。インキュベーション後、1x PBSを10% FBS入りの1x PBS0.5 mLに加えてトリプシンを中和し、激しくピペッティングして細胞を再懸濁して単一細胞懸濁液を得ます。
8. 細胞を765 x gで5分間室温でペレット化し、上清を捨てて、10% FBSを含む1x PBSの5 mLに再懸濁します。この手順を一度繰り返します。
9. 細胞懸濁液を適切な装置を用いて蛍光活性化細胞選別(FACS)にかけます。最終母集団が少なくとも95%純粋であることを確認してください)。
10. 選別後、細胞を滅菌した1x PBS、ペレット(430 x g、室温で5分間)で洗浄し、滅菌した1x PBSに再懸濁します。細胞は、RNA単離またはタンパク質分析のための特定のプロトコルに従って処理することができます。
11. 各アッセイを3回繰り返します。これには、各細胞系統の3D培養をコントロールとして含めます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
U937	アメリカンタイプカルチャーコレクションATCC	CRL-1593.2	単球性細胞株/組織球性リンパ腫
THP-1	アメリカンタイプカルチャーコレクションATCC	TIB-202	単球性細胞株/急性単球性白血病
MCF-10Aの	アメリカンタイプカルチャーコレクションATCC	CRL-10317	非形質転換乳房細胞株
MCF-7	アメリカンタイプカルチャーコレクションATCC	HTB-22	乳がん細胞株
MDA-MB-231	アメリカンタイプカルチャーコレクションATCC	HTB-26	乳がん細胞株
RPMI 1640 ミディアム	GIBCO BRLライフテクノロジーズ	11875-093
DMEM/F12	GIBCO BRLライフテクノロジーズ	〒11039-021
抗生物質/抗真菌薬	GIBCO BRLライフテクノロジーズ	15240-062	100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、0.25 μg/mL ファンギゾン
ウシ胎児血清	GIBCO BRLライフテクノロジーズ	16000-044
馬の美容液	GIBCO BRLライフテクノロジーズ	16050114
0.05% トリプシン-EDTA 1X	GIBCO BRLライフテクノロジーズ	〒25300-062
PBS 1X(リン酸緩衝生理食塩水)	GIBCO BRLライフテクノロジーズ	20012年027
上皮成長因子(EGF)	ペプロテック	AF-100-15 (1.00mg)
インスリン	シグマ・アルドリッチ	I1882-100MG
ヒドロコルチゾン	シグマ・アルドリッチ	H088-5Gシリーズ
コレラ毒素 コレラ菌	シグマ・アルドリッチ	C8052-1MG
マトリゲル	コーニング株式会社	356237	Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)マウス肉腫、細胞外マトリックス抽出物、-20°Cで保存し、4°Cで使用するまで
カバー付きLab-Tekチャンバースライド(8ウェル)	ナルゲ・ヌンク・インターナショナル	177402

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