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1. 脱細胞化
>注:この手順は、脂肪の脱細胞化に焦点を当てた以前に発表された方法から適応されました。これには、DNAを効率的に除去するためのドデシル硫酸ナトリウムではなく、デオキシコール酸ナトリウムイオン性洗剤が含まれていました。
- 1日目に、冷凍した乳腺脂肪パッドまたはMFPを-80°Cから取り出し、室温で解凍します。
- 解凍したら、繊細なタスクワイプでMFPを短時間乾かします。分析スケールを使用して複合機の重量を量ります。
- ハサミまたはメス付きの一対の鉗子を使用して、組織を無傷のECMの研究用の3 mm x 3 mm x 3 mmサンプルに分割し、残りの組織をハイドロゲル生成用に分割します
手記：サンプルの数は試験方法の数によって異なりますが、例えば、パラフィン包埋用(ステップ1.5)とクライオスタット包埋培地での凍結用(必要に応じて1つ)の2つのサンプルの収集を以下に説明します(材料表およびステップ1.6を参照)。
- ティッシュの重さを量ります。切片化のためにパラフィンに埋め込む場合は、ステップ1.5に進みます。切片化のためにクライオスタット包埋培地で凍結する場合は、ステップ1.6に進みます。
- ケミカルフードに、組織を10%中性緩衝ホルマリン(NBF)(材料表を参照)に4°Cで24時間浸漬し、PBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。組織を30%スクロースに4°Cで48時間沈めます。
- このピースが取り外されたので、ティッシュの重さを量ります。手順 1.6 に進みます。
- ケミカルフードに、クライオスタット埋め込み培地で調製したラベル付きカセットにMFPピースを入れます。組織を覆うために、クライオスタット埋め込み培地をさらに追加します。
- カセットを、液体窒素で予冷した2-メチルブタン(材料の表を参照)のビーカーに入れます。ビーカーには、底を覆うのに十分な2-メチルブタンが含まれている必要がありますが、クライオスタット埋め込み媒体が2-メチルブタンに触れないようにするため、カセットを沈めるには十分ではありません。カセットを2-メチルブタン中に置いたままにして、クライオスタット包埋培地が凍結して不透明になるまで待ちます。
- カセットをホイルで包み、ラベルを貼り、切片化に使用するまで-80°Cで放置します
手記：クライオスタット包埋培地に直ちに置かれた組織を5 μmで切片化し、スクロースでインキュベートされた組織を30 μmで切片化して脂肪細胞の形態を保持しました。
- 鉗子を使用して、残りの組織を手動でマッサージします。
手記：ティッシュピースは、10%NBFに24〜48時間入れ、PBSですすぎ、パラフィンに包埋するまで70%エタノールに放置することもできます。包埋後、5 μm 切片をヘマトキシリンおよびエオシン(H & E)の染色に使用できます(以下のセクション 2 を参照)。
- MFPを5mLの0.02%トリプシン/ 0.05%EDTA溶液を入れた6cmの皿に入れます。.37°Cで1時間インキュベートします。インキュベーターに入れる前に、皿に70%エタノールをスプレーして拭いてください。
- 0.7 mmストレーナを使用して、ティッシュに水を3回注ぎ、MFPを脱イオン(DI)水で洗います。鉗子を使用して、洗浄の合間に組織を手動でマッサージします。
- デリケートな作業でティッシュを短時間乾燥させ、拭いて重さを量ります。適切なサイズの攪拌子が入ったオートクレーブ済みのビーカーにティッシュを置きます。組織1gあたり60mLの3%t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(材料表を参照)で組織を覆い、室温で1時間攪拌します。最低20mLを使用してください。
- ティッシュと内容物をストレーナーに捨てます。ビーカーをDI水ですすぎ、ティッシュに注ぎます。さらに 2 回繰り返します。鉗子を使用して、すすぎの合間に組織を手動でマッサージします。
- デリケートな作業でティッシュを短時間乾燥させ、拭いて重さを量ります。ティッシュと攪拌子を同じビーカーに戻し、ティッシュ1gあたり60mLの4%デオキシコール酸で覆います。室温で1時間撹拌します。最低20mLを使用してください。
- ティッシュと内容物をメッシュストレーナーに捨てます。ビーカーをDI水ですすぎ、ティッシュに注ぎます。さらに 2 回繰り返します。鉗子を使用して、すすぎの合間に組織を手動でマッサージします。
- デリケートな作業でティッシュを短時間乾燥させ、拭いて重さを量ります。
- 1%ペニシリン-ストレプトマイシンを補給した真水DIと同じビーカーに組織を置きます。パラフィンフィルムでしっかりと覆います。4°Cで一晩放置します。
- 翌日使用するために、ストレーナーとビーカーを洗ってください。
- 2日目は、ビーカーの中身をストレーナーに排出します。デリケートな作業でティッシュを短時間乾燥させ、拭いて重さを量ります。
- 複合機を同じビーカーに適切なサイズの攪拌棒で入れます。ティッシュ1gあたり60mLの4%エタノール/ 0.1%過酢酸溶液で覆います。.最低20mLを使用してください。室温で2時間撹拌します。
- ティッシュと内容物を0.7mmのストレーナーに捨てます。鉗子を使用して、組織を手動でマッサージします。中身をビーカーに戻します。ティッシュ1gあたり60mLの1x PBSで覆ってティッシュを洗います。最低20mLを使用してください。室温で15分間撹拌します。一度繰り返します。
- ティッシュと内容物を0.7mmのストレーナーに捨てます。鉗子を使用して、組織を手動でマッサージします。中身をビーカーに戻します。ティッシュ1gあたり60mLのDI水で覆ってティッシュを洗います。最低20mLを使用してください。室温で15分間撹拌します。一度繰り返します。
- デリケートな作業でティッシュを短時間乾燥させ、拭いて重さを量ります。ティッシュと内容物をストレーナーに捨てます。鉗子を使用して、組織を手動でマッサージします。
- 中身をビーカーに戻します。組織1gあたり60mLの100%n-プロパノールで組織を覆います。最低20mLを使用してください。室温で1時間撹拌します。
- デリケートな作業でティッシュを短時間乾燥させ、拭いて重さを量ります。ティッシュと内容物を0.7mmのストレーナーに捨てます。鉗子を使用して、組織を手動でマッサージします。
- 中身をビーカーに戻します。ティッシュ1gあたり60mLのDI水で覆ってティッシュを洗います。最低20mLを使用してください。室温で15分間撹拌します。3回繰り返します。
- ティッシュと内容物をストレーナーに捨てます。手順2.3〜2.6を繰り返して、ショ糖インキュベーションとクライオスタット包埋培地での凍結のための組織片を採取します。
- デリケートな作業でティッシュを短時間乾燥させ、拭いて重さを量ります。ラベル付きの15 mLチューブに入れます。-80°Cで一晩凍結します。