動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. ブレオマイシン治療
- 腫瘍細胞生着の 14 日前にマウスにブレオマイシンを気管内注射することを計画します。
- ブレオマイシンストックを注入の2時間前に氷上で解凍します。.
- 解凍後、ブレオマイシンを所望の使用濃度(0.02 U/50 μLまたは0.005 U/50 μL)に希釈し、氷上に保ちます
手記：ブレオマイシンの濃度は、実験に使用したマウス系統によって異なります(表1)。マウスでのブレオマイシンの滴定は、最適な用量を決定するために実行する必要があります。.
- ケタミンとキシラジンをそれぞれ10 mg / mLと1 mg / mLの最終濃度に希釈して麻酔を準備し、1 mLの注射器と27 Gの針を使用して、それぞれ100 / 10 mg / kgの腹腔内ケタミン/キシラジン溶液を各マウスに注射して麻酔をかけます。
- マウスの呼吸を監視し、つま先をつまむ方法を採用します。マウスがつま先のつま先に反応しない場合は、適切な麻酔を確認してください。麻酔下での乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を塗ります。
- 挿管プラットフォームに一度に1匹のマウスを置き、前歯をプラットフォームに背を向けて吊るします。.
- 光ファイバーイルミネーターを使用して胸の上部を照らし、気管の視覚化を支援します。マウスの口を開け、滅菌した平らな鉗子で舌を優しく引き出します。
- 呼吸を妨げないように、針のない静脈カテーテルを使用してください。気管の開口部から放出される白色光の上にカテーテルを置きます。
- カテーテルの上部が前歯に到達するまで、カテーテルを気管に挿入します。カテーテルの口の開口部から差し込む白色光をイメージして、カテーテルが気管に正しく留まっているか確認します。
- ピペットを使用して、50 μL のブレオマイシンまたはビヒクル (PBS) を直接カテーテルに分注し、全量が吸入されるようにします。この手順は無菌条件下で実行します。
- カテーテルが正しく挿入されている場合、マウスはすぐにカテーテルの内容物を吸い込みます。ボリューム全体がカテーテルを下るまで数秒待ちます。次に、カテーテルを気管から取り外し、10%漂白剤溶液で処分します.
手記：マウス1個あたりのステップ1.7〜1.11の平均時間は約5分です。
- マウスが液体を吸い込んでいない場合は、呼吸を注意深く監視し、カテーテルの位置を調整してください。マウスが呼吸を停止した場合は、すぐにカテーテルを取り外し、マウスが通常どおり呼吸を再開するのを待ってから、カテーテルを再挿入します。
- 注入したマウスを、回復のために背中の平らな面にあるIACUC承認の加熱パッドに置きます。全体の手順には、マウスあたり10分かかります。注射を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物の会社に戻さないでください。
- 「使用中の有害化学物質」カードをケージに24時間置きます。
2. 肺腺がん細胞株の生着
>注:ブレオマイシンの注射から14日後に細胞の生着を行います(ステップ1.1)
- ステップ1.3.
に記載されているように、対応する培地を使用して、注射日の3日前に75 cm2フラスコで細胞を乱さずに増殖させます
手記：それらは、注射の日に80%コンフルエントであるべきである(これは、細胞株に応じて各フラスコの2-3 x 106に相当 )。
- 75 cm2フラスコで増殖した細胞を、室温で5 mLのPBSで洗浄します。
- PBSを吸引し、1.5mLのトリプシンを細胞に加え、細胞が剥離するまで(通常は2〜5分)細胞を37°Cでインキュベートします
手記：プラスチックからの細胞の剥離については、フラスコの底を簡単に視覚化するか、光学顕微鏡で確認することを2分ごとに行うことをお勧めします。トリプシンとのインキュベーションは5分を超えないようにしてください。
- 10%FBSを含む4mLの培地(ステップ2.1と同じ培地)を追加してトリプシンを中和します。細胞を15 mLチューブに集め、200 x gで室温で3分間遠心分離します。
- 培地を吸引し、細胞ペレットを5 mLのPBSに再懸濁して細胞を洗浄します。細胞を200 x gで室温で3分間遠心分離し、細胞をペレット化します。これを1回繰り返します。
- PBSを吸引し、フラスコあたり1.5mLのPBSにペレットを再懸濁します。
- 50 μLの細胞混合物と50 μLのトリパンブルーを混合し、Cell Counter/Hemocytometerチャンバーを使用して細胞をカウントします。
- 細胞をPBSで希釈して細胞懸濁液を調製し、マウス1匹あたり50μLに1 x 105細胞(または指示された他の量)を注入します。注入前に細胞を氷上に保管してください.
手記： 細胞懸濁液が不足しないように、少なくとも2倍の細胞を注入用に準備します。
- ケタミンとキシラジンをそれぞれ10 mg / mLと1 mg / mLの最終濃度に希釈して麻酔を準備し、1 mLの注射器と27 Gの針を使用して、それぞれ100/10 mg / kgで腹腔内にケタミン/キシラジン溶液を注入することにより、各マウスを麻酔します。
- マウスの呼吸を監視し、つま先をつまむ方法を採用します。マウスがつま先のつま先に反応しない場合は、適切な麻酔を確認してください。麻酔下での乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を塗ります。
- 挿管プラットフォームに一度に1匹のマウスを置き、前歯をプラットフォームに背を向けて吊るします。.
- 光ファイバーイルミネーターを使用して胸の上部を照らし、気管の視覚化を支援します。
- p200ピペットを使用して細胞を穏やかに再懸濁し、細胞が凝集を形成しないことを確認します。マウスの口を開け、滅菌した平らな鉗子で舌を優しく引き出します。
- 呼吸を妨げないように、針を抜いた状態で静脈カテーテルを使用してください。気管の開口部から放出される白色光の上にカテーテルを置きます。
- カテーテルの上部が前歯に到達するまで、カテーテルを気管に挿入します。カテーテルの口の開口部から差し込む白色光をイメージして、カテーテルが気管に正しく留まっているか確認します。
- ピペットを使用して、50 μLの細胞を直接カテーテルに分注し、全容量が吸入されるようにします。この手順は無菌条件下で行ってください。
手記：カテーテルが正しく挿入されている場合、マウスはすぐにカテーテルの内容物を吸い込みます。
- 全ボリュームがカテーテルを下るまで数秒待ってから、カテーテルを気管から取り外し、10%漂白剤溶液で廃棄します。
- マウスが液体を吸い込んでいない場合は、呼吸を注意深く監視し、カテーテルの位置を調整します。マウスが呼吸を停止した場合は、すぐにカテーテルを取り外し、マウスが通常どおり呼吸を再開するのを待ってから、カテーテルを再挿入します。
手記：ステップ 2.11 から 2.18 のマウス 1 回あたりの平均時間は約 5 分です。
- 注入したマウスを、回復のために背中の平らな面にあるIACUC承認の加熱パッドに置きます.
手記：全体の手順には、マウスあたり10分かかります。注射を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物の会社に戻さないでください。
- B6129SF1/Jや他のマウスの腹側と背側の両方の肋骨領域全体を黒毛で剃る前に電気シェーバーで剃ります。
- 細胞注入の2〜3分後に、インスリン針を使用して100μLのルシフェリンを眼窩後(15 mg / mL)に注入します。イメージングセッションごとに注射に使用する眼を交互に行います。
- 少なくとも2分後、最大5匹のマウスを動物生物発光イメージャーに背側横臥位で置き、発光設定を使用して腹側画像を取得します。
- コントロールパネルの下で、特定の細胞株の発光を測定するための解像度と感度の設定を調整します。ほとんどのアプリケーションでは、3分(または飽和している場合は「自動」)から開始し、ビニング=中(4)、F /ストップ= 1、視野= D、被写体の高さ= 1.50.
手記：注射が成功すると、発光信号が胸部上部、片方の肺、または両方の肺で検出されます。
- マウスを胸骨の横臥位に反転させ、上記のように背側の画像を取得します.
手記：細胞注入が適切に行われないと、細胞が気管の入り口や首に集まってしまうことがあります。
- ケトプロフェン5 mg / kgを腹腔内に注射して痛みを軽減します。.
- マウスをケージに戻し、「BSL-2 Agent in Use」カードをケージに置きます。
- 挿管直後、その後マウスが麻酔から目覚めるまで15分ごとにマウスの呼吸困難を監視します。マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。
- 挿管後24時間および週に3回、罹患の兆候がないかマウスを検査します。
- 手術日、動物の識別、手術の種類、麻酔薬の種類、術後のモニタリング観察と時間を記録してください。
- 体重減少、呼吸困難、行動異常、および体調スコア<2(脊柱のセグメンテーションが明らか/背側骨盤骨が触知可能)についてマウスを監視します。ブレオマイシンの接種後隔週< />
手記：肺腫瘍のあるマウスは、呼吸器刺激、体重減少、悪液質、および/または死亡を示すことがあります。
- 呼吸困難下のマウス、または二酸化炭素またはケタミン/キシラジンによる体重の15%の減少を経験したマウスを安楽死させ、組織を採取する場合は子宮頸部脱臼を引き起こします。呼吸活動のための触診を行うことにより、安楽死を確認します。
3. 生物発光イメージングによる腫瘍増殖のモニタリング
- 生着後3日目とその後毎週、マウスのイメージングを繰り返します。
- ケタミン/キシラジンを注射(ステップ2.4-2.5で説明)または吸入イソフルラン(2%)によりマウスを麻酔します。マウスの呼吸をモニターし、つま先をつまむことで適切な麻酔がかかっているか確認します。麻酔下での乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を塗ります。
- B6129SF1/Jや他の黒毛のマウス系統の腹側と背側の両方で、イメージング前に電気シェーバーを使用して肋骨全体を剃ります。
- マウスが麻酔下に入ったら、インスリン針を使用して100μLのルシフェリンを眼窩後向き(15 mg / mL)注射します。.2分待ちます。イメージングセッションごとに注射に使用する眼を交互に行います。
- マウスをイメージャーに置き、ステップ2.22〜2.24で説明されているように背側と腹側の画像を取得します。
- イメージング後、マウスをケージに戻し、回復のために平らな面に仰向けに置きます.
手記：全体の手順は、5匹のマウスのグループごとに5分かかります。マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。
- イメージャー/生物発光解析ソフトウェアを使用して画像を解析します。
