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1. 3つの独立したアファチニブ耐性PC-9細胞株の樹立
- 3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)アッセイを使用したPC-9細胞の初期アファチニブ曝露濃度の決定。
- PC-9細胞をウシ胎児血清(10%)、ペニシリン(100 U/mL)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)を含む増殖培地で、細胞培養処理した10 cmディッシュ、5% CO2インキュベーター、37°Cで
培養します。
- PC-9細胞を増殖培地で4 x 104細胞/mLに再懸濁し、96ウェルマイクロプレートで50 μL/ウェルで播種します。細胞の最終濃度は2.0 x 103細胞/50 μL/ウェルです。5% CO2インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートします。
- 50 μLのアファチニブ溶液を、0、0.002、0.006、0.02、0.06、0.2、0.6、2、6、および20 μMの異なる濃度で、増殖培地を含むウェル(50 μL)に加えます。アファチニブの最終容量と濃度は、それぞれ 100 μL と 0、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、および 10 μM です。
- 96ウェルプレートを5% CO2インキュベーターで37°Cで96時間インキュベートします。
- 各ウェルに15 μLの色素溶液(材料表を参照)を加え、5% CO2インキュベーター(37 °C)で4時間インキュベートした後、100 μLの可溶化/停止溶液(材料表を参照)を各ウェルに加え、5% CO2インキュベーター(37 °C)で一晩インキュベートします。
- マイクロプレートリーダーを使用して、570 nm(OD570)での光学密度を測定します(材料の表を参照)。6〜12回の反復を準備し、実験を少なくとも3回繰り返します。
- 統計ソフトウェア(資料表を参照)を使用して、これらのデータを半対数グラフとしてグラフィカルにプロットし、反応を最大値の50%に減少させる薬物濃度であるIC50値を計算します(資料表を参照)。
- PC-9細胞の不可逆的EGFR-TKI、アファチニブへの3つの独立した10cm皿での段階的な用量漸増への連続曝露
- PC-9細胞を10 mLの増殖培地を含むp100皿で培養します。PC-9細胞がサブコンフルエント期に達したら、1 mLの細胞懸濁液を9 mLの成長培地とともに3つの新しいp100皿に移します。1:10で希釈したPC-9細胞は、3〜4日でサブコンフルエントになり、細胞数は約4〜5×105細胞/mLになります。
- 翌日、アファチニブのIC50値の1/10を3つのp100皿のそれぞれに加えます
注:アファチニブは、1 μM、10 μM、100 μM、1 mM、および5 mMのストック濃度でDMSOに再構成されます。1〜10 μLのアファチニブ溶液を、必要な最終濃度に従って、培養物中の10 mLの成長培地に加えます。
- アファチニブ含有p100皿中の細胞が亜コンフルエントになったら、1 mLピペットで吸引してよく混合し、新しいp100皿の9 mLの新鮮増殖培地に1 mLの細胞懸濁液を加えます。次に、新しい培養物に10〜20%高濃度のアファチニブを追加します。
- アファチニブ濃度を10〜12か月の期間にわたって各ステップで10〜20%増加させた段階的な用量漸増により、培地中のアファチニブ濃度を0.1nM〜1μMに増加させます。
手記： アファチニブ濃度がIC50値に近づくと、細胞増殖はかなり遅くなります。細胞が1:9に分割されると、これらの細胞は高濃度のアファチニブによって殺されるため、細胞が増殖しない可能性があります。したがって、アファニチブの濃度が高いと、細胞を1:2の比率で分割できます。最も耐性のある細胞は、アファチニブ含有培地で3〜14日間増殖させ、耐性細胞を継代する必要があるまで培地を交換しませんでした。
- アファチニブ耐性細胞を1 μMのアファチニブ含有増殖培地で2〜3ヶ月間培養します。アファチニブ濃度が1μMの場合、このモデルではアファチニブに対する耐性を発現するのに10〜12か月かかります。MTTアッセイを実施して、細胞がアファチニブに耐性があることを確認します。独立して確立された3つのアファチニブ耐性細胞株は、AFR1、AFR2、およびAFR3と名付けられました。