ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍サンプルの調製:非小細胞肺がん(NSCLC)からの組織および細胞学サンプルを保存するためのプロトコル

要約

出典:Ilié, M., et al.非小細胞肺がん患者の生検および細胞診サンプルに22C3抗PD-L1抗体濃縮液を使用。J. Vis. Exp.(2018年)。

このプロトコルは、非小細胞肺癌(NSCLC)の組織および細胞学サンプルを保存するために使用されるホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍サンプルの調製を説明しています。

プロトコル

1. 腫瘍組織サンプルの調製

1. 腫瘍組織をカセット内の10%中性緩衝ホルマリン(NBF)に固定します.
   手記：近位肺腫瘍からの腫瘍組織は、一般に、呼吸器科医または肺専門医による中程度の鎮静下で行われる気管支鏡検査によって得られます。末梢病変およびびまん性肺疾患については、経気管支または針生検が必要です。これらの手順は通常、手術室または集中治療室で行われます。
2. カセットをparaffin.
   に埋め込む 手記：固定は、解剖直後の灌流または浸漬によって達成でき、通常は8〜10時間かかります。固定液の容量は、試料の容量の15〜20倍である必要があります。生検組織を10時間以上固定することは、過剰に固定すると抗原がマスキングされる可能性があるため、推奨されません。固定速度は室温で約1mm/hです。
3. 固定された組織サンプルにワックスをティッシュプロセッサーに浸潤します(材料の表を参照).
   手記：脱水症は、濃度が70%、85%、および90%増加する3つのアルコール浴で行われます。水は、最終的に3つの絶対アルコール浴によって除去されます。清澄化は3つのトルエン浴で行われ、ワックスはホットワックス浴(44〜60°C)に浸潤します。
4. 溶融パラフィンを充填した型(材料の表を参照)に組織を埋め込み、固化するのを待ちます。
5. パラフィン包埋組織をミクロトーム上に3 μmの厚さで切片
化します。
6. パラフィンリボンを正に帯電した顕微鏡スライドガラスに移します(材料の表を参照)。
7. スライドを37°C.
   で1時間乾燥させます 注:組織切片は2〜8°C(推奨)または25°Cまでの室温で保存して抗原性を維持し、切片化から15d以内で染色してください。

2. 細胞診サンプルの調製

1. 気管支洗浄液を防腐剤溶液に集めます(材料の表を参照).
   手記：このために、標準的な気管支鏡検査技術が使用されます。
   1. サンプリングする気管支の分布を洗浄します。洗浄液を清潔な容器に集めます。容器に患者の姓名、生年月日、検体ソースのラベルを付けます。
2. 気管支洗浄液を50mLのコニカルチューブに移し、2gのDL-ジチオスレイトール粉末(材料の表を参照)を加え、チューブを30分間ボルテックスした後、室温で250 x gで5分間遠心分離します。
3. 上清を取り除き、粘液溶解液10 mLを加えます(材料表を参照)。
4. サンプルを中速(レベル9)で20分間振とうし、室温で250 x gで5分間遠心分離します。
5. 上清を取り除き、10%NBFを含む収集チューブに細胞ペレットを沈着させます。
6. 細胞ペレットにCell Block Preparation Reagent(材料表を参照)を4滴加えます。
7. 細胞ペレットをカセットに移し、10% NBFに固定し、細胞ブロックの調製と切片化のためにパラフィン包埋します(ステップ1.1〜1.7を参照)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NovaPrep 本社	ノバサイト	NAの	防腐剤溶液 細胞診標本
ノバプレップ® HQ+ B	ノバサイト	NAの	粘液溶解性溶液
ティッシュテックVIP 6	さくら	6042 VIPの6
ティッシュテック TEC 5 ティッシュ 組み込みコンソールシステム	さくら	5229 TECの5
顕微鏡スライドガラス スーパーフロストプラス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4951プラス4
DL-ジチオスレイトール粉末	シグマ・アルドリッチ	D3801
ハイドルフ マルチ リアックス ボルテックス シェイカー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	13-889-410
シャンドンサイトブロック	サーモフィッシャーサイエンティフィック	7401150