コロニー形成アッセイ:コロニー形成肺がん細胞に対する抗がん剤の有効性の評価

要約

出典:Lee, J. Y.et al, Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts.J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、肺がん細胞が無限に増殖し、個々のコロニーを形成する能力を決定するのに役立つコロニー形成アッセイについて説明しています。コロニー形成細胞に対する抗がん剤の効果は、コロニー形成細胞の数や大きさの変化を解析することで解析できます。

プロトコル

1. コロニー形成アッセイ

1. 10% FBS(ウシ胎児血清)と1%抗生物質を75 cm²フラスコに添加したRPMI1640細胞培養培地15 mLにA549細胞を20,000細胞/cm²の濃度で培養し、_CO2インキュベーター(37°C、_CO2)を5%で37°C、5%CO2で培養します。
2. 実験当日は、血球計算盤を用いて細胞濃度を測定します。1.5 mLの微量遠心チューブに400 x gで7分間遠心分離して50,000個の細胞を回収し、1.5 mLチューブに1x 滅菌PBS(リン酸緩衝生理食塩水)100 μLで細胞を再懸濁します。
3. 1.1 mLの半固体メチルセルロースベースの培地(MCBM)を15 mLチューブにマルチピペットで分注します。各条件に1本のチューブを用意します。
4. P200マイクロピペットを使用して、110 μLのFBSを1.1 mLのMCBMに加えます。
5. 1,000細胞/mLで細胞を播種します。P2マイクロピペットを使用して、ストック溶液(1x PBS100 μLに50,000細胞)から2.4 μLの細胞懸濁液を回収し、10% FBSを添加したMCBM1.1 mLに加えます。
6. 細胞を添加した後、チューブを1分間ボルテックスし、垂直に最高速度で保持して、MCBMと細胞をよく混合します。
7. 試験化合物(OT48単独またはA1210477と組み合わせて)を添加します。使用する溶媒(ここではジメチルスルホキシド(DMSO))のコントロールとして別のチューブを準備します。化合物の濃度と各条件に添加される量に応じて、溶媒制御には、溶媒によって引き起こされる悪影響を評価するために、試験化合物の希釈に使用される最高濃度の溶媒が含まれます。
8. ボルテックスチューブを1分間
。
9. 各アッセイについて、混合物1000マイクロピペットを1 mLを12ウェル細胞培養プレートの中央ウェルに加えます。
10. 空のウェルに1 mLの滅菌水または1x PBSを入れて湿度を安定させます。
11. 培養プレートをインキュベーター内で37°C、5%_CO2で10日間インキュベートします
12. 10日間のインキュベーション後、MTT(メチルチアゾリルジフェニル-テトラゾリウムブロマイド)ストック溶液(5 mg/mL)を200 μLを各ウェルに加え、最終濃度1 mg/mLにします。
13. インキュベーター内で37°Cおよび5%CO₂のインキュベーターで10分間インキュベートします。生存可能なコロニーは紫色に変わります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
A549	ATCCの	CCL-185	37°C
RPMIの1640	ロンザ	30096	4°C
FBSの	バイオウエスト	S1520-500	-20°C
ペニシリン-ストレプトマイシン	ロンザ	17-602E	-20°C
細胞培養用フラスコ T75	SPLの	70075	RT
PBSソリューション	ハイクロン	SH30256.02	RT
1.5mlチューブ	エクストラジーン	チューブ-170-C	RT
15mlチューブ	ヒュンダイマイクロ	H20015-J	RT
12ウェルプレート	SPLの	30012	RT
メトカルト	StemCellテクノロジー	4230	-20°C
チアゾリルブルー臭化テトラゾリウム(MTT粉末)	シグマ	M5622	4°C
LAS4000	GEヘルスケアテクノロジーズ		RT

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