ゼブラフィッシュ異種移植糸アッセイ:ゼブラフィッシュの腫瘍原性に対する治療薬の抗がん効果をIn vivoで評価する方法

要約

出典:Lee, J. Y et al., Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts.J. Vis. Exp. (2018年度)

このビデオでは、in vivoでの腫瘍形成を評価し、治療薬の効果を研究するためのゼブラフィッシュ異種移植アッセイについて説明しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ゼブラフィッシュ異種移植片アッセイ

>注:この技術的なアプローチは、概略図として視覚化されています(図1)。

1. ストック試薬の調製
   1. 1 Lの30x Danieau溶液を調製します:1740 mM NaCl、21 mM KCl、12 mM MgSO₄•7H2O、18 mM Ca(NO₃)₂、および150 mM HEPES。pHメーターを使用して、バッファーのpHを7.6に調整します。
   2. 1%(50x)トリカイン溶液を調製する:20 mgのエチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸(トリカイン)を2 mLの蒸留水に溶解します。
   3. 1%フェノールレッド-PBS溶液を調製する:1.5μLチューブ内の滅菌済みPBS溶液198μLにフェノールレッドナトリウム塩溶液2μLを加えます。
   4. 3%メチルセルロースを調製する:1x Danieau溶液100 mLにメチルセルロース3 gを加えます。
2. ゼブラフィッシュの卵の生産と孵化
   1. 28.5°Cの暗所で、UV滅菌およびろ過された水道水で満たされた仕切りタンクで、メスのゼブラフィッシュ1匹とオスのゼブラフィッシュ1匹を分離します。分離の24時間後、両方の性別の魚を混ぜて交配を開始します。受精卵を交配水槽から5mLの新鮮なダニオー溶液が入ったシャーレに移します。
   2. 卵を5mLのダニオー溶液で3回洗います。洗浄は、ピペットで卵を慎重に吸引し、5mLの新鮮な溶液に移します。28.5°Cで8時間インキュベートします。
      1. ダニオー溶液で8時間のインキュベート後、0.03%の1-フェニル-2-チオ尿素(PTU)を含むダニヨー溶液に変更して色素沈着を抑制します。不透明な卵子(未受精卵または未発達の胚を含む卵子)を選別して、汚染を防ぎます。
3. 胚のデコレーション
   1. 受精後24時間(HPF)、鋭い鉗子を使用してゼブラフィッシュの胚をデコリオネートします。孵化胚をDanieauの溶液で0.03% PTU含有、28.5°C、48 hpfまでインキュベー
   トします。
4. 化合物処理細胞調製
   1. 25 cm²培養フラスコでA549細胞を20,000細胞/cm²で播種します。播種の24時間後、化合物(ここではOT48を50 μMおよび/またはA1210477 20 μM)をインキュベーターで37 °Cおよび5% CO₂で24時間追加します。
   2. 各化合物の処理時間を設定して、細胞の生存率を維持しながら、細胞死に向けてコミットします。この時点は、細胞の生存率、形態、分子マーカーに基づいて個別に設定する必要があります。
   3. 処理終了の2時間前に、4 μMの蛍光セルトラッカー色素CM-Dilで細胞を37°Cおよび5%CO₂で染色します。インキュベーションの2時間後、0.05%トリプシン-EDTAで細胞をトリプシンし、注入前に106個の細胞を50μLのフェノールRed-PBS溶液で希釈します。
5. 異種移植片形成のためのがん細胞のマイクロインジェクション
   1. ゼブラフィッシュが寒天プレートに落ち着くまで、0.02%トリカイン溶液で5分間麻酔をかけます。
   2. マイクロピペットプーラー(プログラム設定:P:300、熱:260、プル:60、VEL:50、時間:200)で1.0mm(外径(OD)ガラスキャピラリー)を引っ張ります。マイクロキャピラリーをシリンジで切断し、鋭いエッジを作ります。マイクロキャピラリーに20 μLの細胞/フェノールRed-PBS溶液をロードします。注入圧力と注入時間を設定して、注入ごとに 2 nL を塗布します。
   3. 100〜200個の細胞を卵黄嚢に注入し、3〜5回の注入で6〜10nLを注入します。注射後、PTU溶液を含む新鮮なダニオー溶液5mLで魚を10〜30分間回復させます。PTU溶液を含む1 mLのDanieau溶液を含む24ウェルプレートで魚をディスパッチし、28.5°Cで72時間インキュベー
   トします。
   4. インキュベーションの72時間後、0.02%トリカイン溶液で魚を麻酔し、3%メチルセルロースを滴下してスライドガラスに固定します。蛍光顕微鏡法により、波長620〜750nmの5倍写真を撮影します。
   5. ImageJソフトウェアによる蛍光腫瘍のサイズの定量化。メニュー「分析 |測定」。蛍光シグナルに対応する値を保存し、統計ソフトウェアでグラフィカルに表示します。

結果

図1:ゼブラフィッシュ異種移植アッセイの全体的なプロセスの概略図。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
A549	ATCCの	CCL-185	37°C
RPMIの1640	ロンザ	30096	4°C
FBSの	バイオウエスト	S1520-500	-20°C
ペニシリン-ストレプトマイシン	ロンザ	17-602E	-20°C
細胞培養用フラスコ T25	SPLの	70025	RT
細胞培養用フラスコ T75	SPLの	70075	RT
細胞培養用フラスコ T175	SPLの	71175	RT
1.5mlチューブ	エクストラジーン	チューブ-170-C	RT
24ウェルプレート	SPLの	30024	RT
ペトリディッシュ	SPLの	10100	RT
PBSソリューション	ハイクロン	SH30256.02	RT
トリプシン-EDTA	ギブコ	〒25-300-054	4°C
塩化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	71382	RT
塩化カリウム(KCL)	シグマ・アルドリッチ	P9541	RT
硫酸マグネシウム七水和物(MgSO4.7H2O)	シグマ・アルドリッチ	M2773	RT
硝酸カルシウム四水和物(Ca(NO3)2)	シグマ・アルドリッチ	C1396	RT
HEPESソリューション	シグマ・アルドリッチ	H0887-J	RT
3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸(トリカイン)	シグマ・アルドリッチ	E10521	RT
フェノールレッド溶液	シグマ・アルドリッチ	P0290	RT
メチルセルロース	シグマ・アルドリッチ	M0512	RT
1-フェニル-2-チオ尿素(PTU)	シグマ・アルドリッチ	P7629	RT
CM-ジル染料	インビトゲン	C7001	-20°C
ガラスキャピラリー	世界の精密機器	TW 100F-4	RT
マイクロピペットプーラー	シャッター計器(アメリカ)	P-97	RT
マイクロインジェクター	世界の精密機器	PV820	RT
注射器	コバックス	1ミリリットル	RT
マイクロローダー	エッペンドルフ	5242956003	RT
スライドガラス	マリエンフェルド	HSU-1000612	RT
蛍光顕微鏡	ライカ	ドイツ/DM 5000B	RT

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