In vitro光毒性アッセイ:肺がん細胞における光増感剤の光毒性の可能性を評価するためのPDTベースの方法

要約

出典:Chang, J. E., et al.肺がん標的ナノ粒子を用いた光線力学療法の抗がん効果。J. Vis. Exp.(2016年)。

光線力学療法(PDT)は、肺がん治療のための非侵襲的かつ非外科的な方法です。光増感剤は腫瘍組織に選択的に蓄積し、酸素と適切な波長の光の存在下で腫瘍細胞死を引き起こします。このプロトコルビデオでは、PDTベースの方法を使用して、肺がん細胞の潜在的な光増感剤の光毒性の可能性を評価します。

プロトコル

1. ヒアルロン酸セラミド(HACE)の合成

1. 12.21 mmolのヒアルロン酸(HA)オリゴマーと9.77 mmolのテトラ-n-ブチルアンモニウム水酸化物(TBA)を60 mlの二重蒸留水(DDW)に可溶化します。30分間攪拌します。
2. DS-Y30リンカーを合成するには、8.59 mmolのDS-Y30セラミドと9.45 mmolのトリエチルアミンを25 mLのテトラヒドロフラン(THF)に溶解します。THF中の8.59mmolの4-クロロメチルベンゾイルクロリドと混合します。60°Cで6時間撹拌します。
3. 合成した 8.10 mmol の HA-TBA と 0.41 mmol の DS-Y30 リンカーを THF とアセトニトリルの混合物 (4:1, v/v) に溶解します。40°Cで5時間撹拌します。
4. フィルター剤でろ過して不純物を取り除き、真空蒸着により有機溶剤を除去します。透析膜(分子量カットオフ:3.5 kDa)を用いて精製し、凍結乾燥します。

2. ナノ粒子の調製

1. HB1mgとパクリタキセル1mgをジメチルスルホキシド(DMSO)0.5mlに溶解し、ボルテックス混合により0.5mlの重圧水と5分間混合して混合する。次に、さらに5分間ボルテックス混合することにより、その混合物にHACEを可溶化します。
2. 溶媒を除去するには、窒素ガスの穏やかな流れの下で70°Cで4時間加熱します。
3. HACE、HBおよびパクリタキセルからなるフィルムを1mlの重水素減少水で再懸濁してください。シリンジフィルター(孔径0.45μm)でろ過し、カプセル化されていない薬物を除去します。

3. 体外光毒性

1. 肺がん細胞株におけるナノ粒子の取り込み
   1. 10%(v / v)ウシ胎児血清と1%(w / v)ペニシリン-ストレプトマイシンを含むRPMI-1640培地を調製します。
   2. 24ウェル細胞培養プレートでA549細胞を1×10⁵細胞/ウェル(各グループごとに3倍)の密度で播種します。加湿した5%_CO2および95%の空気雰囲気で37°Cで24時間インキュベートします。
   3. 細胞接着後、培地を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1 mLを加えて細胞を洗浄します。
   4. ナノ粒子をPBSに溶解し、最終濃度2μM/ml HBにします。次に、各ウェルにPBS、空のNP、HB-NP、またはHB-P-NPの1 mLと細胞を4時間暗所でインキュベー
   トします。
   5. すべての溶液を取り除き、冷たいPBS1 mlを加えて細胞を洗浄します。洗濯手順をもう一度繰り返します。新鮮な培地を追加します。
2. 細胞生存率アッセイ
   1. 細胞培養プレートをPDTファイバーの下(PDTファイバーからウェルまでの距離1cm)に置きます。レーザー保護メガネを着用し、PDTレーザー(630 nm、400 mW/cm²)で、0、5、10、20、30、40秒(0、2、4、8、12、16 J/cm²)のさまざまな時間、暗闇で細胞を照らします。その後、細胞を暗所で24時間インキュベートします。
   2. 培地を吸引し、1mlの冷たいPBSを加えて細胞を洗浄します。洗濯手順をもう一度繰り返します。
   3. 各ウェルに10 μlの細胞毒性測定溶液を加えます。暗闇で2時間インキュベートします。
   4. マイクロプレートリーダーを使用して450nmでの吸光度を測定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
オリゴヒアルロン酸	バイオランド(株)
DS-Y30(セラミド3B、主にノレオイル-フィトスフィンゴシン)	斗山バイオテック株式会社
アジピン酸ジヒドラジド	シグマ・アルドリッチ	A0638 (英語
N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド	シグマ・アルドリッチ	39391
4-(クロロメチル)塩化ベンゾイル	シグマ・アルドリッチ	270784
パクリタキセル	タイフアコーポレーション
シリンジフィルター	ザルトリウス・ステディム・バイオテック社	17762	15 mm、RC、PP、0.45 μm
RPMI-1640	ギブコ・ライフ・テクノロジーズ株式会社	11875
ペニシリン-ストレプトマイシン	ギブコ・ライフ・テクノロジーズ株式会社	15070
ウシ胎児血清	ギブコ・ライフ・テクノロジーズ株式会社	16140071
Celite (フィルター剤)	シグマ・アルドリッチ	6858	ステップ 1.4 を参照してください

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