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動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. ヒアルロン酸セラミド(HACE)の合成
- 12.21 mmolのヒアルロン酸(HA)オリゴマーと9.77 mmolのテトラ-n-ブチルアンモニウム水酸化物(TBA)を60 mlの二重蒸留水(DDW)に可溶化します。30分間攪拌します。
- DS-Y30リンカーを合成するには、8.59 mmolのDS-Y30セラミドと9.45 mmolのトリエチルアミンを25 mLのテトラヒドロフラン(THF)に溶解します。THF中の8.59mmolの4-クロロメチルベンゾイルクロリドと混合します。60°Cで6時間撹拌します。
- 合成した 8.10 mmol の HA-TBA と 0.41 mmol の DS-Y30 リンカーを THF とアセトニトリルの混合物 (4:1, v/v) に溶解します。40°Cで5時間撹拌します。
- フィルター剤でろ過して不純物を取り除き、真空蒸着により有機溶剤を除去します。透析膜(分子量カットオフ:3.5 kDa)を用いて精製し、凍結乾燥します。
2. ナノ粒子の調製
- HB1mgとパクリタキセル1mgをジメチルスルホキシド(DMSO)0.5mlに溶解し、ボルテックス混合により0.5mlの重圧水と5分間混合して混合する。次に、さらに5分間ボルテックス混合することにより、その混合物にHACEを可溶化します。
- 溶媒を除去するには、窒素ガスの穏やかな流れの下で70°Cで4時間加熱します。
- HACE、HBおよびパクリタキセルからなるフィルムを1mlの重水素減少水で再懸濁してください。シリンジフィルター(孔径0.45μm)でろ過し、カプセル化されていない薬物を除去します。
3. 担がんマウスにおけるin vivo抗がん効果
- 肺がん誘発マウスモデル
- 1 × 10個の 6 個の A549 細胞を 0.1 mL の RPMI-1640 培地で調製し、氷中に保ちます。
- キシラジンとチレタミンとゾラゼパムの混合物(1:2、1 ml / kg)のi.P注射でマウスを麻酔します。マウスの皮膚の小さなひだを優しくつまむことにより、適切な麻酔を確認します。麻酔下での乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください.
手記：動きが観察されない場合、動物は実験を開始するために十分に麻酔されます。
- BALB/C雄ヌードマウス(6〜7週齢、20〜22g)の左脇腹に細胞を皮下注射します。
- マウスがケージの周りを動き始めるまで観察し続けます.
手記：動物が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物の会社に戻さないでください。マウスを特定の病原体フリー(SPF)条件下で保管してください。
- 毎日ノギスで腫瘍のサイズを測定します。腫瘍の体積(mm3)を(長さ×幅2)/ 2として計算します。腫瘍の大きさが体積で約200 mm3に達したら、実験を開始します。
- 抗がん剤効果試験
- マウスをランダムに4つのグループ(各グループでn = 10)に分けます。
- キシラジンとチレタミンとゾラゼパムの混合物(1:2、1 ml / kg)のi.P注射でマウスを麻酔します。マウスの皮膚の小さなひだを優しくつまむことにより、適切な麻酔を確認します。麻酔下での乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください.
手記：動きが観察されない場合、動物は実験を開始するために十分に麻酔されます。
- ナノ粒子をPBSに溶解し、最終濃度2 mg / ml HBにします。PBS、遊離HB、HB-NP、HB-P-NPを尾静脈(HBとして2 mg / kg)から0日目と7日目に2回注射します。
- マウスがケージの周りを動き始めるまで観察し続けます.
手記：動物が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物と一緒に戻さないでください。ケージを暗くし、特定のSPF条件下で保管してください。
- 各注射の24時間後に、キシラジンとチラタミンとゾラゼパムの混合物(1:2、1 ml / kg)のI.P.注射でマウスを麻酔します。.マウスの皮膚の小さなひだを優しくつまむことにより、適切な麻酔を確認します。麻酔下での乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください.
手記：動きが観察されない場合、動物は実験を開始するために十分に麻酔されます。
- 腫瘍部位をPDTファイバーの下に置きます(PDTファイバーから腫瘍までの距離は1cmです)。レーザー安全メガネを着用し、スイッチをオフにし、PDTレーザー(630 nm、400 mW / cm2)で腫瘍を500秒間(200 J / cm2)1日目と8日目に2回照射します。
- マウスがケージの周りを動き始めるまで、マウスを観察し続けます。動物が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物と一緒に戻さないでください。
- ケージはSPF条件下で保管してください。レーザー治療後24時間、ケージを暗闇に置き続けます。
- 腫瘍の体積と腫瘍部位の変化を毎日視覚的に監視します。ノギスで腫瘍のサイズを測定し、体積を(長さ×幅2)/ 2(mm3)として計算します。PDT後の腫瘍表面の変化を確認するために、毎日腫瘍部位の写真を撮ります。
- 16日目に、イソフルランを使用した終末麻酔により、グループごとに5匹のマウスを犠牲にします。
- 鉗子とはさみで、外側の皮膚を切り取り、腫瘍を露出させます。慎重に収穫してください。10%ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色して組織学的解析を行います。
- 45日間のモニタリング後、イソフルランを用いた終末麻酔により、残りのマウスを犠牲にします。