低周波超音波アプリケーション:ヒト白血病細胞に対する超音波処理の影響を決定する方法

要約

出典:Trendowski, M. et al. Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells. J. Vis. Exp. (2015).

このビデオでは、低周波超音波を使用してヒト白血病細胞の選択的損傷について説明しています。前臨床のin vitro条件における低周波超音波のこの適用は、白血病および正常細胞に対する超音波処理の影響を調べ比較するために細胞破壊を達成できることを実証している。

プロトコル

1. 細胞と培地の調製

1. 240 mlのIscove's Modified Dubecco's Medium(IMDM)と50 mlのウシ胎児血清を使用して培地を調製します。ウシ胎児の血清を温水浴で解凍しないでください、急激な温度上昇は血清の安定性を損なう可能性があるためです。240 μlのゲンタマイシン50 mg/mlと5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン100xを標準培養フラスコに混ぜ合わせ、培地に加えます。培地は4°Cで保管してください。
2. 調製した培地を用いて、25 cm²フラスコに~4 x 10⁴細胞/mLでU937細胞を播種します。TC20セルカウンターとトリパンブルー排除法を用いて、15-20μlの細胞と15-20μlのトリパンブルーをマイクロ遠心チューブに入れ、内容物を混合することにより、細胞の濃度と生存率を評価します。この混合物をTC20サンプリングスライドに15-20μlをピペットで入れ、スライドをTC20セルカウンターに置いてカウントを開始します。
3. 細胞を37°Cおよび5%_CO2でインキュベートし、トリパンブルー排除とTC20セルカウンターを使用して細胞生存率を確認します。細胞が適切な濃度にあるとき、および/または適切な時間枠でソノセンシタイザーで処理されたら、培養フラスコから3 mLの細胞を20 mLのガラスシンチレーションバイアルに移します。このプロトコールでは、U937細胞を48時間増殖させた後、0.5、1、または5 mM MeβCDで30分間処理し、超音波処理前に細胞のコレステロールを十分に枯渇させます。

>2. 細胞の超音波処理

1. 脱気、真空とブフナーフラスコを使用して蒸留水を脱イオンします。水をカップホーンに移し、ホーンの上部から15mmの高さまで満たします。超音波処理プロセスは、数分間の期間にわたって水のさらなる脱気を引き起こし、サンプルの超音波処理の前にシステムが実行されない場合、実験の過程で不整合を引き起こす可能性があります。したがって、サンプルの超音波処理の前に~7分間システムを実行してください。
2. 細胞を含むシンチレーションバイアルを保持装置に取り付けます。次に、保持装置をカップホーンの上部に取り付け、ホーンの上部から15mmの高さに設定します(スライド機構を使用して水面で)。
3. 細胞は、典型的には、超音波の3つの1秒パルスを用いて超音波処理され、これらのパルスのそれぞれの間に1秒の間隔を空ける。このプロトコルでは、上記のパルス投与を使用して、33%および50%の振幅で細胞を超音波処理します。

3. 超音波処理後の細胞の損傷評価

1. トリパンブルーとTC20セルカウンターを使用して、懸濁細胞の損傷と生存率を評価します。さらに、Z2カウンターを使用してサンプルを分析します。Z2カウンター分析では、100 μLの細胞懸濁液を20 mLの等張生理食塩水(200:1の比率)にピペットで移します。分析の前に、Z2粒子分析装置の開口部を等張生理食塩水を使用して少なくとも2回洗い流します。Z2サンプルをカウンターホルダーに入れ、カウントを開始する前にプラットフォームを開口部まで上げます。
2. TC20およびZ2カウンターからデータを取得するには、メーカーが提供するソフトウェアを使用します。これらのデータを分析して、細胞の損傷、生存率、および超音波処理による細胞破片の生成を確認します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes	ライフテクノロジー	12440079
ウシ胎児血清	シグマ・アルドリッチ	12105
ゲンタマイシン50mg / ml	シグマ・アルドリッチ	G1397
ペニシリン/ストレプトマイシン100x溶液	ライフテクノロジー	〒10378-016
バイオ・ラッド TC20 自動セルカウンター	バイオ・ラッド	〒145-0102
トリパンブルーソリューション	シグマ・アルドリッチ	T8154
Falcon 50 ml & 25 ml ベント式培養フラスコ	フィッシャーサイエンティフィック	353082
100 μl マイクロピペット	ウィートン	851164
1,000 μl マイクロピペット	ウィートン	851168
U937 ヒト単球性白血病細胞	ATCCの	CRL1593.2
THP1ヒト単球性白血病細胞	ATCCの	TIB-202
Branson SLPe 40kHz セルディスラプター 3インチ (25mm) カップホーン付き	ブランソン超音波	〒101-063-726	超音波処理装置
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® ソフトウェア	ベックマン・コールター	6605700
Seal-Rite 1.5 ml 微量遠心チューブ	USAサイエンティフィック	1615-5510
ベックマン・コールター Accuvette ST 25 ml バイアル&キャップ	ベックマン・コールター	A35473 (英語)
AccuJet Proオートピペット	ブランドテックサイエンティフィック	26330
USAサイエンティフィック10ml使い捨て血清ピペット	USAサイエンティフィック	〒1071-0810
Tip 100 μl および 1,000 μl フィルターチップ	USAサイエンティフィック	1120-1840、1126-7810
BioRad デュアルチャンバーカウンティングスライド	バイオ・ラッド	〒145-0015
20 mlガラスシンチレーションバイアル	シグマ・アルドリッチ	Z190527
ウィートン250mlフラスコ	シグマ・アルドリッチ	Z364827