XTT Assay:細胞の生存率とミトコンドリア活性を評価するための比色アッセイ

要約

Trendowski, M., et al. Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells. J. Vis. Exp. (2015年)

この記事では、細胞の生存率とミトコンドリア活性を評価するための比色アッセイであるXTTアッセイのプロトコルについて説明します。

プロトコル

1. 処理されたU937およびTHP1細胞の細胞生存率とミトコンドリア活性を測定するためのXTTアッセイ

1. XTTアッセイの前に、同じ条件下でU937細胞とTHP1細胞を増殖させます。超音波処理の30分前に、同じ濃度範囲のMeβCDで細胞を前処理してください。以前と同じ超音波パラメータを使用しますが、細胞は1秒間隔で1〜3パルスの範囲を使用して超音波処理され、XTTキットが評価する損傷の範囲を発症します
   手記：これらの手順の多くは、XTTキットのマニュアルから直接取得されており、関心のあるラボの便宜のためにのみ繰り返されています。
2. 200 x gで10分間遠心分離して細胞を回収し、前述の増殖培地に細胞ペレットを再懸濁します。細胞を~1 x 10⁵細胞/mlで再懸濁し、U937細胞をウェルあたり100 μlで平底の96ウェルマイクロタイタープレートに三重に播種し、別の96ウェルプレートを使用してTHP1細胞について繰り返します。ブランク吸光度の読み取り値として、100 μlの完全な増殖培地のみを含む3つのコントロールウェルを含めます。その後、接種したプレートを24時間インキュベートします。
3. 使用前に、XTT試薬と活性化試薬の2つのアリコートを37°Cで解凍してください。透明な溶液が得られるまで、アリコートを穏やかに渦巻かせます。0.1 mLの活性化試薬を5.0 mLのXTT試薬に加えると、1つの96ウェルマイクロタイタープレートアッセイに十分な活性化XTT溶液が形成されます。他のプレートについてもこのプロセスを繰り返します。
4. 各ウェルに50 μlの活性XTT溶液を加えます。プレートを細胞培養用CO₂インキュベーターに2時間戻します。インキュベーション期間後にプレートを静かに振って、ポジティブウェルのオレンジ色を均等に分配します。マイクロタイタープレートリーダーを使用して、細胞を含むアッセイウェルとブランクバックグラウンドコントロールウェルの吸光度を450〜500 nmの波長で測定します。
5. ブランクコントロールウェルを使用してマイクロタイタープレートリーダーをゼロにするか、特定の結果からそれらの平均値を差し引きます。630〜690 nmの波長ですべてのアッセイウェルの吸光度を再度測定し、得られた450〜500 nmの値から値を差し引きます。注:この2回目の吸光度測定は、アッセイ結果から非特異的な測定値を排除するのに役立ちます。XTTアッセイを両方の細胞株について4回繰り返しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
イスコーブの変更されたダルベッコのミディアム w/ NaHCO3 & 25mM Hepes	ライフテクノロジー	12440079
Branson SLPe 40kHz セル ディスラプター with 3インチ(25mm)カップホーン	ブランソン超音波	〒101-063-726	超音波処理 デバイス
Tip 100 μl および 1,000 μl フィルターチップ	USAサイエンティフィック	1120-1840、1126-7810
100 μl マイクロピペット	ウィートン	851164
1000 μl マイクロピペット	ウィートン	851168
Forma Scientific デュアルチャンバー water ジャケット付きインキュベーター	フォーマ・サイエンティフィック	3131
XTT細胞増殖アッセイキット	ATCCの	30-1011K
96ウェルマイクロプレートリーダー	コール・パーマー	EW-13055-54
U937 ヒト単球性白血病細胞	ATCCの	CRL1593.2
THP1ヒト単球性白血病細胞	ATCCの	TIB-202

1 個 名 の