ブロモデオキシウリジンパルス標識アッセイ:細胞増殖を測定する技術

要約

出典: Welschinger R. et al. Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization. J. Vis. Exp. (2015)

ビデオでは、細胞増殖を測定するためのブロモデオキシウリジン(BrdU)による哺乳類細胞の段階的なパルス標識アッセイについて説明しています。BrdUの取り込みにより、特定の時点で合成段階にあった細胞を、細胞を同期させることなく、時間的に追跡することができます。

プロトコル

1. 溶液と試薬

1. 完全なRPMI
   1. 56 mLの子牛胎児血清(FCS)と5.5 mLの200 mM L-グルタミンを500 mLのRPMI-1640培地ボトルに加えます。
2. BrdUストックソリューション
   1. 32.5 mM BrdU(10 mg/ml)をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に調製します。
3. BrdUコンプリートRPMI
   1. 6.2 μlのBrdUストック溶液を10 mLのComplete RPMIに加えます。
4. DNaseソリューション
   1. DPBSで1 mg DNase / mlを調製します。
5. 染色バッファー
   1. DPBS中に3%の熱不活化FCSと0.09%のアジ化ナトリウムを調製します。
6. 固定バッファー、透過化バッファー、洗浄バッファーの定義については、材料リストを参照してください。

2. セル

>注:細胞は6か月を超えて培養されませんでした。この方法は、細胞密度と培養培地を調整することで、非接着性細胞株に直接適応できます。実験の開始時に指数関数的に成長している細胞を使用してください。

1. T-75培養フラスコ中のNALM6細胞をComplete RPMIで維持します。クラスIIバイオセーフティキャビネットを使用して、無菌条件下ですべてのステップを実行します。
2. NALM6細胞を1〜2 x 10⁶細胞/mLに維持し、培養液を週3回分割します。
3. 空気中の5%_CO2中で37°Cでインキュベートします。

3. BrdUによる細胞のパルス標識

>注意:BrdUは変異原および催奇形物質の可能性があるため、取り扱いには注意してください。

1. 細胞を150 x gで5分間遠心分離
   手記：細胞を新鮮な培地に移すと、結果の再現性が向上します。
2. 細胞カウントを行い、Complete RPMIで細胞を2 x 10⁶細胞/mLで再懸濁します。
3. 細胞をBrdU Complete RPMIで1:2に希釈し、最終細胞濃度1 x 10⁶細胞/mLを調製します。
4. 37°Cで5%_CO2と45分間インキュベートし、その後、細胞を10分の1に1回完全RPMIで希釈します。細胞を150 x gで5分間遠心分離し、すべての上清を慎重に廃棄します。
5. 少量 (~100 μl) の完全 RPMI に細胞を再懸濁し、細胞数を計数して 1 x 10⁶ 細胞/mL に調整します。
6. 1 mLの細胞を48ウェルプレートのウェルにピペットで移します。1 mLのDPBSを空いているウェルにピペットで移し、より再現性の高い結果を得ることができます。
7. 37 °C で 5% CO₂ 中、空気中で所望の時点 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、および 24 時間でインキュベートします
   手記：時間の長さは、実験計画が何を測定することを目的としているかによって異なります。
8. ピペットを使用してすべての細胞をFACSチューブに移します。1 mLの容量のPBSでウェルを順番にすすぎ、最終総容量が5 mLになるまで洗い流します。
9. 150 x gで5分間遠心分離し、すべての上清を慎重に取り除きます。細胞を染色する準備ができたら、すぐにこれ(セクション4)を実行します。

4. 細胞染色

>注:細胞の表面染色が必要な場合は、固定前にそれを行い、細胞が全体を通して4°Cに保たれていることを確認してください。

1. 細胞を100 μLの染色バッファーに再懸濁します (オプションの表面染色の場合は、推奨量の抗体を表面抗原に添加し、4°Cで30分間インキュベー
トします)。
2. 1 mLの染色緩衝液を加え、150 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます
   注:特異的な抗体、濃度、インキュベーション時間などは、特定の実験目標によって異なります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ナルム6	DSMZの	ACC-128
5-ブロモ-2′-デオキシウリジン	シグマ	B5002-1Gの
RPMI 1,640 (L-Gln 500 ml	ロンザ	12-167階
DPBSの	ロンザ	17-512階
ウシ胎児血清	フィッシャーバイオテック	FBS-7100113
CO2インキュベーター	バインダー	C 150
BDファルコン12 x 75 mm FACSチューブ	BDバイオサイエンス	352008
BD LSR FORTESSAフローサイトメーター	BDバイオサイエンス	フォルテッサ
遠心機	スピントロン	GT-175Rの

なし)