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1. 溶液と試薬
- 完全なRPMI
- 56 mLの子牛胎児血清(FCS)と5.5 mLの200 mM L-グルタミンを500 mLのRPMI-1640培地ボトルに加えます。
- DNaseソリューション
- DPBSで1 mg DNase / mlを調製します。
- 染色バッファー
- DPBS中に3%の熱不活化FCSと0.09%のアジ化ナトリウムを調製します。
- 固定バッファー、透過化バッファー、洗浄バッファーの定義については、材料リストを参照してください。
2. 細胞染色
>注:細胞の表面染色が必要な場合は、固定前にそれを行い、細胞が全体を通して4°Cに保たれていることを確認してください。
- 細胞を100 μLの染色バッファーに再懸濁します (オプションの表面染色の場合は、推奨量の抗体を表面抗原に添加し、4°Cで30分間インキュベー
トします)。
- 1 mLの染色緩衝液を加え、150 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます
手記：特異的な抗体、濃度、インキュベーション時間などは、特定の実験目標によって異なります。
- 固定と透過化
- 細胞を100 μlの固定緩衝液に再懸濁し、室温で15分間インキュベー
トします。
- 1 mLの洗浄バッファーを加え、150 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
- 細胞を100 μlの透過化バッファーに再懸濁し、細胞を氷上で10分間インキュベートします。
- 1 mLの洗浄バッファーを加え、150 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
- チューブあたり100 μlの固定緩衝液に細胞を再懸濁し、室温で5分間インキュベー
トします。
- 1 mLの洗浄バッファーを加え、150 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます
注:必要に応じて、ここでプロトコルを一時停止できます。固定細胞は、染色バッファーに再懸濁すると、4°Cで数日間安定です。遠心分離後は、先に進む前に染色バッファーを取り出してください。
- DNase処理
- 細胞を100 μlのDNase溶液 (30 μg のDNase/106細胞) に再懸濁し、細胞を37°Cで1時間インキュベー
トします。
- 1 mLの洗浄バッファーを加え、150 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
- 抗体染色
注:BrdU以外の細胞内マーカーの染色は、BrdU染色と同時に行うことができます。
- 重要:未染色の細胞と各蛍光色素で標識された細胞からなるコンペンセーションコントロールを準備します。コンペンセーションコントロールには、実験用チューブに使用した抗体と同じ抗体を使用するのが理想的です。ただし、これが不可能な場合は、同じ蛍光色素に結合した高発現抗原に対する抗体を代替します。
- 細胞を50 μlの洗浄バッファーに再懸濁し、BrdU抗体1 μl/106細胞を加えます
注:他の特異的な細胞内抗原に対する直接標識抗体も追加することができます。
手記：Ser10上でリン酸化されたヒストンH3に対する抗体は、G2とMの細胞を区別するために使用でき、ヒストンH3は有糸分裂中にSer10上でリン酸化されます。Tyr15でリン酸化されたcdc2に対する抗体は、有糸分裂に関与した細胞を検出するために使用できます。
- 細胞を室温で20分間インキュベートします。
- 1 mLの洗浄バッファーを加え、細胞を150 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
- 細胞周期解析のためのDNAの染色
- ペレットをほぐし、7-AAD溶液(0.25μg)20μlを加えます
注:一定量の7-AAD /セルを使用することが重要です。
- 細胞を1 mLの染色バッファーに再懸濁します。