BMSCsを用いた白血病細胞の2D共培養:白血病細胞の亜集団を得る方法

要約

出典:Slone, W. L. et al. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (2016).

このビデオでは、白血病細胞と骨髄間質細胞との長期2D共培養の手法について説明し、骨髄微小環境との相互作用を研究しています。2D共培養モデルは、急性リンパ芽球性白血病細胞と、腫瘍細胞の表現型に影響を与える骨髄間質または骨芽細胞を利用しています。この研究は、骨髄を支えるメカニズムの調査をサポートします 化学療法への曝露中の白血病細胞の生存

。

プロトコル

1. 事前準備

1. 骨髄間質細胞(BMSC)と骨芽細胞(OB)の培養。
   1. BMSCまたはOBの両方を6%_CO2で37°Cに維持し、90%のコンフルエントに達するまで10cmの組織培養プレートで成長させます。
   2. BMSCまたはOB細胞をトリプシン処理し、新しい10cmプレートに1:2で分割します。細胞は、白血病の共培養に必要になるまで、これらの基準で増殖します。

2. 共同文化の確立と維持

1. 腫瘍特異的培養培地10 mL中の5-20 x 10⁶白血病細胞を80%-90%コンフルエントBMSCまたはOBプレート上に加えます><。 注:私たちの研究室では、1%から7%の範囲であることが示されている骨髄微小環境をよりよく再現するために、5%O₂で37°Cで共培養を維持しています。しかし、この酸素圧で共培養を維持することは、3つの白血病亜集団の確立にとって重要ではなく、研究室の裁量に委ねられています。
2. 4^日ごとに、1 mLを除くすべての培地(懸濁液中の白血病細胞を含む)を取り除き、9 mLの新鮮な白血病培地と交換します。プレートから9mlの培地を取り出す際は、骨髄間質細胞(BMSC)や骨芽細胞(OB)の付着層を乱さないように注意してください。
   1. プレートを横に傾けてメディアを取り除き、プレートの隅でメディアを吸引します。さらに、新しいメディアを追加するときは、BMSCまたはOB接着層の混乱を最小限に抑えるために、プレートの角を側壁に対してドロップワイズしてください。
3. 共培養の12^日目以降、BMSCまたはOB層の白血病細胞を、ディッシュの培養培地をディッシュの上で約5〜10回穏やかにピペッティングしてすすぎ、15mlの円錐管に集めます。ステップ 2.1.
   で説明されているように、新しい 80% から 90% のコンフルエント BMSC または OB プレートに再播種します 注:ステップ2.3で説明したように、共培養を穏やかにすすぐと、BMSCまたはOB単層を乱すことなく、浮遊および位相の明るい白血病細胞が除去されます。これにより、腫瘍細胞のみを次の共培養プレートに移すことができます。この12日間のサイクルは、ユーザーのニーズに基づいて必要なだけ繰り返すことができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100 x 20 mm細胞培養ディッシュ	グライナーバイオワン	664160
15 mlの円錐形遠心分離管	ワールドワイドメディカルプロダクツ	41021037	細胞収集に使用
カルチャーメディア
骨芽細胞培養培地	プロモセル	C-27001	ヒト骨芽細胞培地用
RPMI 1640 のメディア	株式会社メディアテック	15-040	腫瘍培地調製用
接着細胞
ヒト骨芽細胞	プロモセル	C-12720	ヒト骨芽細胞は、サプライヤーの推奨に従って培養されました。
ヒトボーンモロー間質細胞	WVU生物試料コア		匿名化された原発性ヒト白血病および骨髄間質細胞(BMSC)は、Mary Babb Randolph Cancer Center(MBRCC)Biospecimen Processing CoreおよびWest Virginia University Department of Pathology Tissue Bankによって提供されました
白血病細胞
REHの	ATCCの	ATCC-CRL-8286	REH細胞は、サプライヤーの推奨および推奨培地に従って培養しました。
SD-1	DSMZの	ACC 366	SD-1は、サプライヤーの推奨および推奨培地に従って培養されました。

の