白血病亜集団の収穫:2D共培養からの白血病細胞亜集団の空間的分離のための方法

Abstract

出典:Slone, W. L., et al. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (2016).

このビデオでは、3つの白血病細胞亜集団の空間的分離の方法を説明しています。これは、培地中に自由に浮遊する懸濁白血病細胞、間葉系細胞単層の表面に付着した位相明るい白血病細胞、および2D共培養により間葉系間質細胞単層の下に移動した薄暗い白血病細胞です。

Protocol

1. 共文化内での3つのサブポピュレーションの分離

1. 懸濁液(S)腫瘍亜集団のコレクション。
   1. ピペットで共培養プレートから培地を吸引し、同じ培地を穏やかに再塗布してプレートをすすぎ、白血病細胞を含む培地を15 mLの円錐管に集めます。収集された白血病細胞はS亜集団です。
2. Phase Bright(PB)腫瘍亜集団のコレクション。
   1. 10 mLの新鮮な培地を共培養プレートに戻します。添加した培地を約5回上下にピペッティングして激しくすすぎ、付着性白血病細胞を除去しますが、付着性BMSC/OB成分を取り除くほど強くはしないでください。
   2. ピペットで吸引し、15mlのコニカルチューブに培地を回収します。収集された細胞がPB亜集団です。
3. Phase Dim(PD)腫瘍亜集団のコレクション。
   1. プレートを1mlのPBSですすいで、残りのメディアを取り除きます。共培養プレートを3 mLのトリプシンでトリプシン化し、37°Cインキュベーターに5分間入れます。
   2. プレートをインキュベーターから取り出し、プレートの側面を軽くたたいて付着したBMSC/OBを取り除きます。
   3. 1 mlのウシ胎児血清(FBS)を加え、ピペットで3〜5回上下させて、大きな細胞凝集体をバラバラにします。
   4. 15 mLの円錐管に細胞を含む培地を回収します。これらの細胞は、BMSC/OBを持つ未精製のPD亜集団でもあります。
4. 分離された3つの亜集団を400 x gで7分間遠心分離し、上清を吸引して廃棄し、ペレットを1 mLの予熱培地に個別に再懸濁します。セルをG10カラムにロードする準備が整いました。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL コニカル遠心チューブ	ワールドワイドメディカルプロダクツ	41021039	防腐剤溶液 細胞診標本
15 mlの円錐形遠心分離管	ノバサイト	NAの	細胞収集に使用
ウシ胎児血清	シグマ	F6178
0.05%トリプシン	株式会社メディアテック	5229 TECの5	25-053-CIの
100 x 20 mm細胞培養ディッシュ	グライナーバイオワン	664160
培養培地
骨芽細胞培養培地	プロモセル	C-27001	ヒト骨芽細胞培地用
RPMI 1640 のメディア	株式会社メディアテック	15-040	腫瘍培地調製用
細胞株
ヒト骨芽細胞	プロモセル	C-12720	ヒト骨芽細胞は、サプライヤーの推奨に従って培養されました。
ヒトボーンモロー間質細胞	WVU生物試料コア		匿名化された原発性ヒト白血病と骨髄間質細胞(BMSC)は、メアリー・バブ・ランドルフがんセンター(MBRCC)の生物試料処理コアとウェストバージニア大学病理学部組織バンクから提供された。BMSC培養は、前述のように確立されました(*)
白血病細胞
REHの	ATCCの	ATCC-CRL-8286	REH細胞は、サプライヤーの推奨および推奨培地に従って培養しました。
SD-1	DSMZの	ACC 366	SD-1は、サプライヤーの推奨および推奨培地に従って培養されました。