G-10カラムベースの白血病細胞ソーティング:骨髄間質細胞から急性リンパ芽球性白血病細胞を精製する方法

要約

出典:Slone, W. L.,et al. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (2016).

このビデオでは、ゲル型10個の架橋デキストランG-10カラムを使用して、骨髄間質細胞から急性リンパ芽球性白血病細胞を分離する様子を説明しています。この方法は、接着性骨髄間質細胞の下に移動した腫瘍細胞の集団を回復させ、「位相薄暗い」腫瘍細胞集団を生成するのに役立ちます。

プロトコル

1. G10カラムへの共培養細胞のロード

>注:セルを含むメディアをG10列に追加する前に、ストップコックが完全に閉じていることを確認してください。また、各亜集団は、ダウンストリーム分析で母集団間にバイアスが生じないように、別々のG10列に対して実行する必要があります。

1. 1,000 μLのピペットを使用して、予熱した培地中の各細胞亜集団1 mLを別々のG10カラムに滴下します。細胞を含む培地がG10ペレットの上部または内部に留まっていることを確認してください。G10ペレット上で細胞をRT.
   で20分間インキュベートします。 手記： ストップコックは、孵卵期間中は閉じたままです。

2. G10カラムからの白血病細胞の採取

1. 1〜3 mLの温めた培地を各G10カラムに加えます。ストップコックバルブを開き、メディアがゆっくりとカラムからドロップワイズに出るのを待ちます.
   手記：カラムからの流速を遅く保つことが重要で、そうしないと BMSC/OB を含む G10 ペレットがカラムから洗い流され、単離された白血病細胞が汚染される可能性があります。
2. 予め加温した培地を少しずつ(1〜2 mL)G10カラムに加え続け、合計15〜20 mLがカラムを通過して収集されるまでします。ストップコックバルブとキャップコレクションチューブを閉じます.
   手記：収集チューブの底にG10粒子ペレットが見られる場合は、G10粒子ペレットを邪魔せずにチューブから媒体をそっと取り出し、新しいチューブに移します。
3. 回収した培地を400 x gでRTで7分間遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを下流のアプリケーションに適したバッファーに再懸濁します。
4. 細胞は現在、BMSCまたはOB汚染のない純粋な白血病細胞の集団であり、ユーザーの裁量でダウンストリームアプリケーションに適用する準備ができています.
   注:白血病細胞の生存率は、細胞をG10カラムに通す際に変化しないはずです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
G10セファデックスビーズ	シグマ	G10120	原稿ではゲル型10架橋デキストラン粒子と表記
10 ml滅菌シリンジ	BDの	309604
一方向ストップコック	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(株)	14054-10
ヒト骨芽細胞	プロモセル	C-12720	ヒト骨芽細胞は、サプライヤーの推奨に従って培養されました。
ヒトボーンモロー間質細胞	WVU生物試料コア		匿名化された原発性ヒト白血病と骨髄間質細胞(BMSC)は、メアリー・バブ・ランドルフがんセンター(MBRCC)の生物試料処理コアとウェストバージニア大学病理学部組織バンクから提供された。BMSC培養は、前述のように確立されました(*)
0.05%トリプシン	株式会社メディアテック	25-053-CIの
REHの	ATCCの	ATCC-CRL-8286	REH細胞は、サプライヤーの推奨および推奨培地に従って培養しました
グラスウール	パイレックス	3950
50 mL コニカル遠心チューブ	ワールドワイドメディカルプロダクツ	41021039	収集チューブとして使用
15 mlの円錐形遠心分離管	ワールドワイドメディカルプロダクツ	41021037	細胞収集に使用
ウシ胎児血清	シグマ	F6178
SD-1	DSMZの	ACC 366	SD-1は、サプライヤーの推奨および推奨培地に従って培養されました。
100 x 20 mm細胞培養ディッシュ	グライナーバイオワン	664160

名 の