眼窩後静脈血サンプリング:マウスの眼窩後洞から単核細胞を分離する方法

要約

出典:Mopin A. et al. A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model. J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、マウスの後眼窩洞からの末梢血採取と、密度勾配遠心分離による血液からの単核細胞のさらなる単離の方法について説明しています。

プロトコル

>1. レトロ眼窩採血

1. 安楽死の直前に、無菌条件下で層流フードと暖房ランプの下でレトロ眼窩採血を行い、低体温症を予防します。
2. 麻酔には、ケタミンを150 mg / kg、キシラジンを10 mg / kgで使用します。.1.5mlのケタミンと0.5mlのキシラジンを18mlのPBS溶液に希釈して麻酔薬溶液を調製します。
3. 毛細血管を眼の内側眼瞼に挿入します。血液は眼窩洞から毛細血管に上昇します。滅菌ガーゼスポンジで眼に優しく圧力をかけ、出血を抑えます。
   手記：この技術を使用して、100〜200μlの血液を採取できます。
4. 血液をEDTAチューブに集め、単核細胞を分離する前にサンプルを氷上に保管します。

2. 血液単核細胞の単離

1. 血液サンプル(1.1で得られた100〜200μl)を微量遠心チューブに移し、溶液容量が500μlになるまでPBS/1 mM EDTA溶液を加えます。血液を含む溶液の下に500μlの分離溶液を30Gの針と1mlの注射器で慎重に重ねます。血液と分離液を混ぜないでください。
2. チューブを800 x g(ブレーキなし)でRTで20分間遠心分離します。遠心分離後、ピペットを使用して細胞リング(不透明な白色層)を回収します。細胞を微量遠心チューブに移します.
   手記：不透明な白い層には、リンパ球と単球が含まれており、分離溶液である下層と上層の間に現れます。
3. PBS溶液1 mLを加え、チューブを350 x gで10分間遠心分離し、細胞を600 μlのFACSバッファーに再懸濁します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ケタミン1000(100mg / ml)	ビルバック	3.59713E+12
キシラジンセダキシラン(20 mg / ml)	CEVAの
PBS溶液(1倍濃縮液)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14190
超高純度 0.5 M EDTA 溶液、pH 8.0	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15575
分離液(パンチョールマウス)	パンバイオテック	品番04-64100
EDTAチューブ	グライナーバイオワン	454034
パスツールピペット 150 mm (キャピラリーチューブ)	フィッシャーブランド	〒1154-6963
フローサイトメトリーチューブ(青)	ベックマン・コールター	2523749
マイクロ遠心チューブ(1.5 ml)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	05-408-129
滅菌ガーゼスポンジ	ウルゴ	501580
30Gの針	ベクトン&ディキンソン	304000
1mlシリンジ	テルモ	SS-01T(ティー)
Shandon Cytospin 3 細胞遠心分離機	サーモフィッシャーサイエンティフィック