方法論記事

May-Grunwald Giemsa染色:骨髄細胞を染色する方法

2023年4月30日

この記事について

要約

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出典:Mopin, A. et al. A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model. J. Vis. Exp. (2016).

このビデオでは、May-Grünwald Giemsa Stainingを使用して骨髄細胞を染色する技術について説明しています。プロトコールでは、マウス骨髄性白血病細胞であるC149細胞を染色し、形態と鑑別カウントを分析します。

プロトコル

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1. C1498細胞株のin vitro特性評価

  1. C1498細胞のin vitro培養
    1. 50 mlのウシ胎児血清(FBS)、5 mlのペニシリン(100 U / ml)-ストレプトマイシン(100 μg / ml)、500 μlの50 mM β-メルカプトエタノール、5 mlのN-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸(HEPES)、5 mlの非必須アミノ酸、および5 mLのピルビン酸ナトリウムを500 mlのRPMI培地に加えて、完全なRPMI(ロズウェルパークメモリアルインスティテュート)1640培地を準備します。
    2. C1498細胞株を完全なRPMIで増殖させます。ピペッティングで懸濁液中の細胞を回収し、細胞を50 mLチューブに移します。350 x gで10分間遠心分離し、上清を取り除きます。
    3. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(1x)溶液20 mLを加え、350 x gで10分間遠心分離し、上清を除去します。
    4. 10 mLの蛍光活性化セルソーター(FAC)バッファー(2.5 gのウシ血清アルブミン(BSA)粉末と2 mLの0.5 Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液、500 mLのPBS溶液)に細胞を再懸濁します。トリパンブルーで細胞を染色した後、Thoma細胞計数チャンバーを使用して細胞をカウントします。

2. 顕微鏡用スライド上の細胞懸濁液の調製

  1. 回収したC1498細胞(ステップ1.1.4で取得)のうち106個を5 mLの冷FACバッファーで2回洗浄し、細胞を1 mLの冷FACバッファーで希釈します。チューブを氷の上に置きます。
  2. スライドをフィルターカードがあらかじめ取り付けられている使い捨てチャンバーに入れ、これらを細胞遠心分離機に入れます。
  3. 各チャンバーとフィルターカードに100 μlのFACバッファーを加え、4.52 x gで2分間遠心します。
  4. 各チャンバーとフィルターカードに100 μlの細胞を添加し、細胞を4.52 x gで2分間遠心します。
  5. スライドをチャンバーから慎重に取り出し、スライドを風乾してから、May-Grünwald Gimsa染色で染色します。

3. May-Grünwald Giemsa(MGG)染色

  1. スライドをMay-Grünwald溶液を含むCoplinジャーに3分間浸して、細胞(セクション2で調製)を染色します。
  2. スライドをpH 6.8緩衝液を含むCoplinジャーに1分間移します。
  3. スライドをGiemsa R溶液(pH 6.8緩衝液で1/20に希釈)を入れたCoplinジャーに10分間入れて染色し、スライドを中性水(pH 7)で10秒間洗浄します。
  4. スライドを水気を切り、風乾します。封入剤2をセルに1滴塗布してスライドを埋込します。カバーガラスの一方の端をスライドに置き、鉗子を使用して慎重に細胞に下げます。カバーガラスを軽く押して、気泡を取り除きます。

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
C1498細胞株 ATCCのTIBの49
2-メルカプトエタノール、ギブコ サーモフィッシャーサイエンティフィック2985
ウシ胎児血清(FBS) サーモフィッシャーサイエンティフィック10270
HEPES、ギブコ(1 M) サーモフィッシャーサイエンティフィック15630
ペニシリン-ストレプトマイシン、ギブコ サーモフィッシャーサイエンティフィック15140
RPMI 1640 Medium (Gibco, GlutaMAX Supplement) サーモフィッシャーサイエンティフィック61870
トリパンブルー溶液(0.4%) サーモフィッシャーサイエンティフィック15250-061濃度 1/2
チャンバー&フィルターカード(EZ Cytofunnel Shandon) サーモサイエンティフィックA78710003
May-Grünwaldの解決策 RAL診断320070
ギムザRソリューション RAL診断320310濃度 1/20
pH 6.8 緩衝液 RAL診断330368
スライド(スターフロスト - グランドエッジ90) ニッテルガラスVS1137#077FKB
顕微鏡カバーメガネ、24 x 24mm ニッテルガラスVD1 2424 Y100
Shandon Cytospin 3 細胞遠心分離機 サーモフィッシャーサイエンティフィック
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pH 6 8 R FACS

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