密度勾配遠心分離法:末梢血からCLL細胞を単離する方法

Abstract

出典:Hay, J. et al. Subcellular Filation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、末梢血から慢性リンパ性白血病(CLL)細胞を分離する技術について説明しています。このプロトコルでは、ヒト患者の血液サンプルからCLL細胞を分離し、その後の核画分および細胞質画分の効率的な生成を実現します。

Protocol

1. 患者の血液サンプルからのCLL細胞の単離

1. 以前に同意したCLL患者からの末梢血サンプルは、EDTA採血チューブでクリニックから受け取られ、白血球数(WCC)が伴います。WCCに従って末梢血CLLサンプルを精製します。WCC < 40 x 10⁶細胞/mLの場合は、ステップ1.1.1に進みます。WCC ≥ 40 x 10⁶細胞/mLの場合は、ステップ1.1.2に進みます。
   1. すべてのEDTA血液チューブの内容物を50 mLの円錐形遠心チューブに注ぎ、血液1 mLあたり50 μLのヒトB細胞濃縮カクテルを追加します。室温(RT)で20分間インキュベートします。ステップ 1.1.2 に進みます。
   2. サンプルをRT CLL洗浄バッファー(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、0.5%ウシ胎児血清(FBS)、および2 mM EDTA)で1:1の比率で希釈します。
2. RT密度グラジエント培地をサンプル用の適切なサイズの円錐形遠心分離チューブに分注します(30 mLのサンプルの場合は10 mLを50 mLチューブに、10 mLのサンプルの場合は4 mLを15 mLチューブに入れます)。
3. 密度グラジエント培地の上にサンプルを慎重に重ね、400 x gでRT.
   で30分間遠心分離します 注:温度の変化により単核細胞の濃縮が不十分になるため、サンプルを遠心分離機に入れる前に遠心分離機がRTになっていることを確認し、突然のブレーキが液体界面を乱す可能性があるため、遠心分離機のブレーキをオフ
にしてください。
4. 密度勾配培地とCLL洗浄バッファーの界面に集まる単核細胞の白い層を、プラスチック製のパスツールピペットを使用して、新鮮な50 mLの円錐形遠心チューブに穏やかに回収します。
5. 単離した単層に40 mLのCLL洗浄バッファーを添加して細胞を洗浄し、300 x gで室温で10分間遠心分離します。
6. 上清を捨て、チューブの底をはじいてペレットを再懸濁し、ステップ1.5で説明した洗浄ステップを繰り返します。
7. 上清を廃棄し、ステップ1.6で説明したようにペレットを再懸濁し、次にペレットを設定容量のCLL洗浄バッファー(細胞ペレットのサイズに応じて最大40 mL)に再懸濁します。
8. トリパンブルーと血球計算盤を使用して細胞をカウントします。次に、フローサイトメトリーに進み、CLL細胞の純度を確認します
   注:この段階では、CLL細胞を実験に使用する培地で10 x 10⁶細胞/ mLの濃度で培養したり、100 x 10⁶細胞/バイアルまでの濃度で将来の研究のために10%ジメチルスルホキシド(DMSO)/ FBSで凍結保存したりできます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15mLチューブ	グリナーバイオワン	188271
1.5 mL微量遠心チューブ	グリナーバイオワン	616201
DMSOの	シグマ	D2650
EDTAの	シグマ	EDSの
ウシ胎児血清	サーモフィッシャー	10500064
Histopaque1077 密度勾配媒体	シグマ	H8889-J
トリパンブルーソリューション	サーモフィッシャー	15250061
PBSタブレット	フィッシャーサイエンティフィック	BR0014G
ロゼットセップヒトB細胞濃縮カクテル	幹細胞技術	15064
シグマ3-16P	サイクイップ		遠心機