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1. CLL細胞からの細胞内画分の調製
>注:実験のセットアップを計画するときは、全細胞抽出物を生成できる未刺激/未処理の細胞のウェルを含めてください。
- 10 – 20 x 106細胞/条件を使用して、MEC1 CLL細胞株または単離された初代CLL細胞の所望の刺激および/または薬物治療を実施します。その後、細胞は、以下で説明するように、細胞内分画または全細胞抽出物の生成に使用されます。
- 溶液/チューブの調製:細胞が回収される前に、分画の日にすべての溶液/バッファーを新たに調製します。必要になるまで溶液を氷上に保管し、調製後4時間以内に使用してください。
- PBS/ホスファターゼ阻害剤溶液:ホスファターゼ阻害剤を1x PBSで1:20に希釈することにより、PBS中のホスファターゼ阻害剤を調製します(すなわち、0.5mLのホスファターゼ阻害剤を9.5mLの1x PBS)
手記： ホスファターゼ阻害剤が沈殿していないことを確認してください。沈殿物が存在する場合は、50°Cに10分間加熱します。
- 低張緩衝液:蒸留水で10倍低張緩衝液を1:10に希釈して(すなわち、50μLの10倍低張緩衝液を450 μ LのdH2Oに)して、1倍低張緩衝液を調製します。
- 10 mM ジチオスレイトール (DTT): 蒸留水で 1M DTT を 1:100 に希釈して 10 mM DTT を調製します (つまり、1 M DTT 10 μL を 990 μL の dH2O に含みます)。
手記： DTTは非常に不安定なので、毎回新しく準備してください。凍結/解凍サイクルの繰り返しを避けてください。
- 完全な溶解バッファー:各実験に必要なバッファーの量を決定します。各サンプルには50 μLの完全な溶解バッファーが必要なため、5 μLの10 mM DTTを44.5 μLの溶解バッファーに加えて、0.5 μLのプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加します。この量は、実験のサンプル数に応じてスケールアップできます。
- 新たに刺激された細胞、新たに生成された細胞質分画、新たに生成された核分画、および全細胞の溶解物に対する各刺激および/または薬物治療ごとに、1.5 mLマイクロフュージチューブを4セット標識します。これらのマイクロチューブを必要になるまで氷上で予冷します。
- 細胞を個々に標識した1.5 mLのマイクロフュージチューブとペレットに移し、200 x gで4°Cで5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞を氷冷PBS/ホスファターゼ阻害剤1 mLに再懸濁します。200 x gで4°Cで5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化し、上清を除去し、細胞ペレットを氷上に保ちます。
- 細胞質分画の調製:細胞内分画に使用する細胞ペレットを50 μLの1x hypotonic Bufferに穏やかに再懸濁します。細胞を氷上で15分間インキュベートして、細胞を膨潤させます.
手記： 使用される低張緩衝液の量は、細胞数に応じて経験的に増やすことができます。
- 0.8 - 2.5 μL (1:20 から 1:60) の界面活性剤を各サンプルに加え、最高設定で 10 秒間ボルテックスします。
- 核画分および細胞質画分を単離するために特定の細胞タイプに使用する界面活性剤の最適濃度を決定するには、最初に界面活性剤グラジエントを実行します。1:20〜1:60の範囲(つまり、2.5μL〜0.8μLの洗剤を50μLのHypotonic Buffer)が適切である必要があります。
手記： ステップ3.4で低張緩衝液の量を調整する場合は、適切な洗剤比率が維持されていることを確認してください。.
- 界面活性剤添加前後の位相差顕微鏡を用いて細胞を観察することにより、細胞溶解を確認します。細胞全体は、密集した暗い核で大きく見えます。細胞質は、核の周りに明るいハローとして現れます.
手記： 適切な溶解は、ウェスタンブロッティングを使用して、界面活性剤の勾配から生成された溶解画分内の特定のタンパク質を分析することにより、さらに確認されます。
- 溶解したら、サンプルを14,000 x gで4°Cで30秒間遠心分離します。
- 上清を事前に冷却した標識されたマイクロフュージチューブに慎重に移します。この細胞質画分は、さらなる分析が必要になるまで-80°Cで保存できます。残りのペレットには核画分が含まれています.
手記： サンプルの凍結/融解サイクルを繰り返さないでください。
- 核画分の調製:ピペッティングを上下させて、各核ペレットを50 μLの完全溶解バッファーに再懸濁します。
注:完全溶解バッファーの容量は、開始セル番号に応じて経験的に調整できます。
- 2.5 μLの界面活性剤を加えて、核膜およびボルテックスに関連するタンパク質を最高設定で10秒間可溶化し、サンプルを氷上で30分間インキュベートします。
- 最高設定で30秒間ボルテックスし、その後、サンプルを14,000 x gで4°Cで20分間遠心分離します。
- 上清をあらかじめ冷却した標識マイクロチューブに移します。この核画分は、さらなる分析に必要になるまで-80°Cで保存できます
手記： サンプルの凍結/融解サイクルを繰り返さないでください。