細胞外フラックスアッセイ:細胞の代謝プロファイルを測定する方法

要約

出典:Hlozkova K. et al. Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (2018).

このプロトコルは、細胞外フラックスアッセイを使用して初代白血病細胞の細胞外酸性化率(ECAR)と酸素消費率(OCR)を測定するための生化学的アプローチを提供します。これらの細胞の代謝プロファイルの評価は、それらの要求を特徴付けるのに役立ち、個別化治療につながります。

プロトコル

1. 試薬の調製

1. 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na₂HPO₄、1.47 mM KH₂PO₄をddH₂Oに溶解して、PBS500 mLを調製します。HClでpHを7.4に調整します。オートクレーブ滅菌します。
2. 100 mLのRPMI培地を調製します:10 %ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン(100 U / mL)、ストレプトマイシン(100 μg / mL)を添加したL-アラニルグルタミンを含むRPMI-1640培地。
3. 蒸留水に0.1 M NaHCO₃ 50 mLを調製します。pHを8.1に調整し、フィルター滅菌(0.22μm)し、4°C.
   で保存します 手記：8ウェル細胞外フラックス分析プレート2枚の場合、0.1 M NaHCO₃ pH 8.1 250 μLを調製します。
4. 蒸留水に2 M D-グルコース1 mLを調製します。フィルター滅菌(0.22μm)し、-20°Cで保存します。
5. 100 μLの1 mMオリゴマイシンAをエタノール溶液で調製します。フィルター滅菌(0.22μm)し、-20°Cで保存します。
6. 1 M 2-デオキシ-D-グルコース(2-DG)をMinimal DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)で250 μL調製します。37°Cに温め、pHを7.4に調整します(pH測定は37°Cで行ってください)。フィルター滅菌(0.22μm)し、-20°Cで保存します。
7. 1 mM FCCP(カルボニルシアン化物-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン)をDMSO中に100 μL調製します。フィルター滅菌(0.22μm)し、-20°Cで保存します。
8. エタノール溶液に1 mM ロテノン 100 μL を調製します。フィルター滅菌(0.22μm)し、-20°Cで保存します。
9. エタノール溶液に1 mg/mLのアンチマイシンAを100 μL調製します。フィルター滅菌(0.22μm)し、-20°Cで保存します。
10. 使用直前に、解糖ストレス試験培地10mLを調製します。水浴で最小DMEMを37°Cに温め、pHを7.4に調整します(pH測定は37°Cで行います)。
11. 使用前に、Cell Mitoストレステスト培地10 mLをBSAで調製します。2 mM L-グルタミン、10 mM D-グルコース、1 mM HEPES (pH 7.4)、1 mM ピルビン酸、0.1 % BSA (ウシ血清アルブミン) で最小限の DMEM を補います。ウォーターバスで37°Cに温め、pHを7.4に調整します(pH測定は37°Cで行ってください)。
12. 使用前に、BSAを含まないCell Mitoストレス試験培地10 mLを調製してください。2 mM L-グルタミン、10 mM D-グルコース、1 mM HEPES(pH 7.4)、および1 mMピルビン酸で最小限のDMEMを補います。温細胞水戸ストレス試験培地をBSAなしの水浴で37°Cまでし、pHを7.4に調整します(pH測定は37°Cで行います).
    注:Cell Mitoストレス試験培地にBSAが添加されるのは、培地にBSAを添加すると細胞がFCCPに対してよりよく反応するためです(異なる条件が試験されました)。BSAを含まないCell Mitoストレステスト媒体は、メーカーが媒体にBSAを使用することを推奨していないため、ポートのロードに使用されます。

2. 単核細胞の一晩培養

>注:滅菌組織培養フードですべてのサブステップを実行します。

1. 20 mLのRPMIを含む2つのT75フラスコを準備します。各フラスコに、30 x 10⁶個の単核細胞を添加します。フラスコを5% CO₂および37°Cで16〜24時間放置して細胞をインキュベー
トします。

3. セル接着剤コーティングプレートの調製

1. 8ウェル細胞外フラックス分析プレート2枚をコーティングします.
   手記：無菌組織培養フードでコーティングを行います。
2. 2.2 μL の細胞接着剤 (密度: 2.54 mg/ml) を 250 μL の 0.1 M NaHCO₃、pH 8.1 に加え、すぐに 12.5 μL の溶液を各ウェルにピペットで
   手記：細胞接着ストック溶液は密度が異なる場合があるため、それに応じてNaHCO₃に添加する量を調整してください。
3. プレートをフードに約20分間置いてから、細胞接着剤を吸引し、200μLの滅菌水を使用して各ウェルを2回洗浄します。井戸が乾くまで、蓋を開けてフードの中に置きます。
4. プレートはすぐに使用するか、結露を防ぐために縁をパラフィンフィルムで包んで4°Cで最大1週間節約します。細胞を播種する前に、プレートがフード内で室温(約20分間)まで温められていることを確認してください。

4. センサーカートリッジの水分補給

>注:2つの8ウェル細胞外フラックスアナライザーカートリッジを水和します。

1. ユーティリティプレートとセンサーカートリッジを分離します。センサーカートリッジを逆さまにしてラボベンチに置きます。
2. ユーティリティプレートの各ウェルに200μLのキャリブラントを充填します。ウェルの外側の周りの各堀に400μLのキャリブラントを入れます。
3. センサーカートリッジを、キャリブラントが入っているユーティリティプレートに戻します。
4. カートリッジアセンブリを加湿された非 CO₂、37 °C インキュベーターに一晩置きます。
5. 細胞外フラックス分析装置の電源を入れ、一晩37°Cまで温めます。

5. 細胞接着コーティングプレートへの細胞の播種

>注:解糖ストレステストには、解糖ストレステスト媒体を使用してください。Cell Mitoストレステストには、BSAを含むCell Mitoストレステスト培地を使用します。

1. 解糖ストレステストとCell Mitoストレステスト用のシードセルを別々のプレートに入れます。各試験について、1つのフラスコの細胞を一晩培養して使用します。
2. 細胞を200 x gで室温で5分間遠心分離します。細胞を適切な培地1 mLに再懸濁し、カウントします。
3. 生細胞4 x 10⁶を最終容量400 μLまで加えます(適切な培地を使用します)。
4. 細胞懸濁液50μLをウェルB-Gにプレートします。500,000個の細胞が1つのウェルに播種されていることを確認します.
   手記：ウェルあたり正確に500,000個の細胞を播種することが重要です。他のノーマライゼーションは行われません。これにより、さまざまな患者の結果を比較できます。ここで説明するように、最適な反復数は 6 です。1次細胞が誤って動作する可能性があるため、より少ない反復を使用することは推奨されません。
5. 180 μLの適切な培地をウェルAおよびHに加えます(これらのウェルはバックグラウンド補正として機能します)。
6. プレートを400 x gで室温で5分間遠心分離し、ブレーキを1に設定します。
7. 2枚の8ウェル細胞外フラックス分析プレートのウェルB-Gに130μLの適切な培地をゆっくりと慎重に加えます。ウェルの底部に細胞が安定して付着していることを顕微鏡で観察し、目視で確認します。
8. プレートを加湿した非_CO2、37°Cインキュベーターに30分間入れます。

6. センサーカートリッジの装填

1. 解糖ストレス試験では、100 mM グルコース、20 μM オリゴマイシン A、および 1 M 2-DG をそれぞれ 250 μL 調製します。これらはすべて解糖ストレス試験培地です。
2. Cell Mitoストレス試験では、20 μMオリゴマイシンA、15 μM FCCP、30 μM FCCP、および10 μMロテノンと10 μg/mlアンチマイシンAの混合物をそれぞれ250 μLを、BSAを含まないCell Mitoストレス試験培地に調製します
   手記：FCCP滴定には十分な患者材料がないため、1回のアッセイで2つの濃度のFCCPを注入することをお勧めします。それにもかかわらず、濃度は研究者によって決定されるべきです。
3. 次のように、コンパウンドをカートリッジの適切なインジェクターポートにロードします(表1)。

7. プログラムの設定

1. 解糖系ストレステストでは、表2の説明に従ってプログラムを設定します。
2. Cell Mitoストレステストでは、表3の説明に従ってプログラムを設定します。
3. プログラムを起動します。キャリブラントプレートをアッセイプレートと交換します(プロンプトが表示されたら)。

港	解糖ストレステスト		セル水戸負荷試験
	ポートへのロード	井戸での最終濃縮	ポートへのロード	井戸での最終濃縮
ある	20 μL の 100 mM グルコース	10 mMグルコース	20 μL の 20 μM オリゴマイシン A	2 μM オリゴマイシン A
イ	22 μL の 20 μM オリゴマイシン A	2 μM オリゴマイシン A	22 μL / 15 μM FCCP	1.5 μM FCCP
ハ	1 M 2-DG 25 μL	100 mM 2-DG	25 μL / 30 μM FCCP	4.5μM FCCPの
ダ	バツ		25 μL の 10 μM ロテノンと 10 μg/mL のアンチマイシン A	1 μM ロテノンおよび 1 μg/ml アンチマイシン A

表 1: コンパウンド ボリューム。

歩	設定
キャリブレーション	自動
平衡	自動
ベースライン測定	3回:ミックス – 3分、待機 – 0分、測定 – 3分
ポートAの注入	注射
測定	3回:ミックス – 3分、待機 – 0分、測定 – 3分
ポートBの注入	注射
測定	3回:ミックス – 3分、待機 – 0分、測定 – 3分
ポートCの注入	注射
測定	4回:ミックス – 3分、待機 – 0分、測定 – 3分

表2:解糖ストレステストのプログラム。

歩	設定
キャリブレーション	自動
平衡	自動
ベースライン測定	3回:ミックス – 3分、待機 – 0分、測定 – 3分
ポートAの注入	注射
測定	3回:ミックス – 3分、待機 – 0分、測定 – 3分
ポートBの注入	注射
測定	3回:ミックス – 3分、待機 – 0分、測定 – 3分
ポートCの注入	注射
測定	3回:ミックス – 3分、待機 – 0分、測定 – 3分
ポートDの注入	注射
測定	3回:ミックス – 3分、待機 – 0分、測定 – 3分

表3:Cell Mitoストレステストのプログラム。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
タツノオトシゴアナライザーXFp	アジレント・テクノロジーズ	S7802A型
タツノオトシゴXFp細胞培養ミニプレート	アジレント・テクノロジーズ	103025から100
Corning™ Cell-Tak 細胞および組織用接着剤	サーモフィッシャーサイエンティフィック	CB40240
D-(+) グルコース	シグマ・アルドリッチ	G7021-100G
オリゴマイシンA	シグマ・アルドリッチ	75351から5MG
2-デオキシ-D-グルコース	シグマ・アルドリッチ	D8375-1Gの
FCCPの	シグマ・アルドリッチ	C2920-10MG
ロテノン	シグマ・アルドリッチ	R8875-1Gの
Streptomyces sp.のアンチマイシンA。	シグマ・アルドリッチ	A8674-25MGの
タツノオトシゴ XF ベース ミディアム 100mL	アジレント・テクノロジーズ	103193から100
L-グルタミン溶液、200 mM	シグマ・アルドリッチ	G7513-100ミリリットル

シリーズ