T細胞濃縮:磁気分離により混合細胞集団からT細胞を単離する技術

要約

出典:Nguyen, H. D., et al. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-vsus-Host Disease. J. Vis. Exp. (2020).

このビデオでは、磁気セパレーターを使用したネガティブセレクションによるマウスの脾臓からのT細胞濃縮について説明しています。この手法では、特定の細胞表面抗原に対する抗体またはリガンドを使用して、サンプル中の他の細胞を枯渇の標的にします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 1日目:ドナーマウスからT細胞を調製

1. CD45.2⁺ H2k^b+ C57BL/6野生型(WT)マウスをT細胞のドナーとして使用します。
2. C57BL/6マウスを二酸化炭素(CO₂)窒息で安楽死させ、意識を失うまで2〜3分待ちます。必要に応じて、二次安楽死として子宮頸部脱臼を行います。
3. マウスの毛皮と皮膚を70%エタノールで徹底的に洗浄します。脾臓とリンパ節を切除し、シリンジプランジャーと40μmメッシュストレーナーを使用して脾細胞の単一細胞懸濁液に分離します。ストレーナーとシリンジプランジャーを1% RPMI(RPMI培地を含む1% FBS)で洗浄し、すべての脾細胞を採取します。
4. 細胞懸濁液を800 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を捨てた後、5 mLのACK溶解バッファー(1 mM Na₂EDTA、10 mM KHCO₃、144 mM NH₄Cl、pH 7.2)を加えます。細胞懸濁液を室温で5分間インキュベートします.
   手記：ACK溶解バッファーは、赤血球の溶解に使用されます。
5. 1% RPMIを5 mL添加して溶解を停止します。800 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
6. 氷冷磁気活性化セルソーティング(MACS)バッファー(0.5% BSA、PBS中2 mM EDTA、pH 7.2)を調製します。使用前にバッファーを脱気してください。細胞ペレットを5 mLのMACSバッファーに再懸濁します。
7. 脾細胞を数え、血球計算盤と1%トリパンブルーを使用して生細胞と死細胞を確認します。2 x 10⁶細胞のアリコートを保存して、フローサイトメトリー分析による精製収量を評価します。
8. 脾細胞をMACS緩衝液中の200 x 10⁶/mLの濃度で再懸濁します。10^{6細胞あたり}、0.03 μLのビオチン抗マウス-Ter-119、0.03 μLの抗ビオチン-抗マウス-CD11b、0.03 μLの抗ビオチン-マウス-CD45R、および0.03 μLのビオチン抗マウス-DX5を添加します。4 °C.
   で15分間インキュベートします。 手記：ビオチン抗マウス-Ter-119、ビオチン抗マウス-CD11b、ビオチン抗マウス-CD45R、および抗ビオチン-マウス-DX5を使用して、それぞれ赤血球、顆粒球、B細胞、およびNK細胞と反応しました。したがって、これらのセルサブセットは次のステップで枯渇します。
9. 10 mLの氷冷MACSバッファーを細胞懸濁液に加えます。800 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
10. 細胞ペレットをMACSバッファーに100 x 10⁶/mLの濃度で再懸濁します。抗ビオチンマイクロビーズ(0.22 μL/10⁶細胞)を脾細胞懸濁液に加えます。よく混合し、4°Cでさらに15分間インキュベートし、細胞懸濁液を10 mLの氷冷MACSバッファーで1回洗浄します。800 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
11. 磁場に磁気分離カラムを置きます。カラムを 3 mL の MACS バッファーですすいでください。細胞懸濁液をカラムに滴下します。結合していない濃縮T細胞からなるフロースルーを、新しい15 mLコニカルチューブに集めます。MS カラムを 3 mL の氷冷 MACS バッファーで洗浄します
    手記：洗浄手順を実行する前に、カラムが空であることを確認してください。
12. 細胞懸濁液を800 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、細胞ペレットを5 mLのMACSバッファーに再懸濁します。
13. 血球計算盤を使用して、1%トリパンブルーの細胞をカウントします。フローサイトメトリーによる純度チェックのために、2 x 10⁶細胞のアリコートを保存します.
    手記：この方法により単離された脾臓T細胞の平均収量は、マウス当たり~20−25×10⁶細胞である。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMIの1640	サーモフィッシャーサイエンクティフィック	11875-093	メディア
ミディMACS	ミルテニーバイオテック	〒130-042-302	T細胞の濃縮
0.5 M EDTA pH 8.0 100ML	フィッシャーサイエンティフィック	BP2482100	MACSバッファ
PBSの10倍	フィッシャーサイエンティフィック	BP3994	MACSバッファ
抗ビオチンマイクロビーズ	ミルテニーバイオテック	〒130-090-485	T細胞の濃縮
対ヒト/マウスCD45R(B220)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒13-0452-85	T細胞の濃縮
抗マウスCD4ビオチン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	13-0041-86	T細胞の濃縮
CD11bの	サーモフィッシャーサイエンティフィック	13-0112-85	T細胞の濃縮
CD25-ビオチン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒13-0251-82	T細胞の濃縮
CD45R	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒13-0452-82	T細胞の濃縮
CD49b モノクローナル抗体 (DX5)-ビオチン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	13-5971-82	T細胞の濃縮
抗マウスTER-119ビオチン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	13-5921-85	T細胞の濃縮
抗マウスCD45.1 PE	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12-0900-83	フローサイトメトリー解析
C57BL/6マウス	チャールズ川	27	寄付者/受信者
フローサイトメトリーチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	352008	フローサイトメトリー解析
セルストレーナー 40 uM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	22363547	細胞調製

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