骨髄由来樹状細胞の作製:マウス骨髄から樹状細胞を作製する方法

1. 骨髄由来樹状細胞(BM-DC)を生成します。

1. WTまたはB6バックグラウンド上の因子B(fB)^-/-マウスの大腿骨および脛骨から骨髄を分離します。簡単に言えば、鉗子とはさみを使用して両足から脛骨と大腿骨を収集します。50 mLコニカルチューブに1% FCSと100 U/mLのペニシリン/ストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン(1% RPMI)を含む氷冷RPMIに入れます。鉗子とハサミを使用してすべての筋肉組織を取り除き、大腿骨と脛骨を完全に洗浄します。大腿骨と脛骨を50mLの円錐管から1%RPMIを含む直径92mmのペトリ皿に移します。はさみを使用して、大腿骨または脛骨の端を切ります。50 mLのチューブに25 mLの1% RPMI 1640培地を満たします。これを使用して、26 G ニードルに取り付けられた 3 mL シリンジに 3 mL の 1% RPMI を充填します。このシリンジを骨に挿入し、プランジャーを押して骨髄(BM)を空洞から1%RPMI(~3 mL/骨)で収集チューブに洗い流します。細胞を800 x gで5分間回転させます。
2. ペレットを5 mLのACK溶解バッファーに再懸濁して、赤血球溶解を行います。細胞懸濁液を氷上で5分間インキュベートします。1% RPMIを10 mLの細胞懸濁液に加えて溶解を停止し、800 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
3. 細胞ペレットを10 mLの培地(10% FBS、100 U/mLのペニシリン/ストレプトマイシン、2 mM l-グルタミン、および50 mM β-メルカプトエタノールを含むRPMI 1640)に再懸濁し、最終濃度の2 x 10⁶細胞/mLを満たすように容量を調整します。
4. 20 ng/mLの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を細胞懸濁液に加えます。骨髄細胞を100 x 15 mmのペトリ皿で37°C、5% CO₂で6日間培養します。
5. 3日目に、進行中の培地の半分(約5 mL)を40 ng/mlのGM-CSFを含む新しい培地と交換します。
6. 培地を37°Cの水浴で予温し、骨髄培養皿から培地を約5mL回収します。800 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞ペレットを40 ng/mL GM-CSFを含む5 mLの培養培地に再懸濁します。
7. 培養の6日目に25 μg/mLのリポ多糖(LPS)を培地に添加してBM-DCを成熟させ、2 x 10⁶細胞のアリコートを保存して、フローサイトメトリーによるDC分化の有効性を決定します。
8. 成熟したBM-DCを収集する:セルリフターを使用して、ペトリ皿からDCを柔らかくこすり落とします。すべての細胞懸濁液を50mLのコニカルチューブに集めます。800 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞ペレットを氷冷したPBS50mLで3回洗浄します。フローサイトメトリーによる免疫学的表現型解析のために、約2 x 10⁶ BM-DCを保存します。