クロマチン剪断法:酵素消化法を用いてクロマチンフラグメントを生成する方法

要約

出典: Fuchs, A. R. et al. A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia. J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、Micrococcal Nuclease酵素消化を使用したクロマチン剪断のプロトコールについて説明しています。クロマチン剪断は、クロマチン免疫沈降法(ChIp)ワークフローにおいて重要なステップであり、ヒト慢性骨髄性白血病細胞におけるタンパク質-DNA相互作用の研究に役立ちます。特徴プロトコルでは、クロマチン剪断は超音波処理を使用して行われます。

プロトコル

1. 固定、細胞溶解、クロマチン剪断

>注:患者サンプルとJurkat細胞は、前述のように変更を加えた製造元の指示に従って、市販のChIPキットで固定および溶解されます。固定は層流フードの下で行われます。

1. 1 mLの37%ホルムアルデヒドを含む1.5 mLチューブ、1.25 Mグリシン1 mLを含む1.5 mLチューブ、4 mLの1x PBSを含む5 mLチューブ、および細胞を固定するための氷の入ったボックスを準備します。
2. それぞれのインキュベーション時間細胞を刺激した後、32.4 nMホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート(PMA)と1 μMイオノマイシンを添加して細胞を刺激します。次に、チューブの蓋を開けた状態で、細胞を37°Cおよび5%_CO2で16時間インキュベートします(汚染を避けるために、空気を透過するシーリングフィルムを使用し、5 mLチューブを200 x gで5分間回転させ、細胞を5 mLチューブ内のPBS500 μLに再懸濁します。
3. 340 μMのホルムアルデヒド(13.5 μLの37%ホルムアルデヒド)を細胞に加えます。慎重にピペッティングで上下させて短時間混合した後、懸濁液を室温で2.5分間(Jurkat細胞)または5分間(患者サンプル)インキュベートします><。 手記：初代細胞が最適なせん断を確保するためには、長時間の固定が必要です。
4. 125 mM グリシン (57 μL の 1.25 M グリシン) を添加して固定を停止し、さらに 5 分間インキュベートします。その後すぐに細胞を氷上に置き、500 x g で 5 分間 4 °C で遠心分離します。上清を吸引して除去します。
5. 細胞を氷冷PBS1 mLで200 x g、4°C、5分間2回洗浄し、毎回吸引して上清を除去します
   手記：固定後、プロトコールを一時停止することができます。固定セルは-80°Cで保存する必要があります。試験のために、以下のプロトコールで使用することを意図した抗体のエピトープが固定によってマスクされていない場合、SDS-PAGEゲル電気泳動およびウェスタンブロットによる分析に追加のサンプルを使用することができます。これらのステップは、製造元の指示に従って100μgのタンパク質で実行されます。すべてのαNFAT2抗体は1:1000の希釈で使用され、GAPDH抗体は1:10000の希釈で使用されます。適切な抗体と不適切な抗体を有するJurkat細胞からの固定サンプルの例示的な画像を図1に示す。
6. ピペッティングを上下させて、市販の溶解バッファー1 5 mLに細胞ペレットを再懸濁します。次に、サンプルを氷の上のシェーカーに置き、振とうしながら10分間インキュベートします.
   手記：溶解に先立ち、細胞を液体窒素中で10秒間崩壊させることができます。これはJurkat細胞には有用ですが、一次患者サンプルでは避けるべきです。崩壊のために、特定の容器内の5〜10mLの液体窒素に5mLのチューブを5秒間入れます。安全メガネと適切な安全手袋を着用してください。
7. その後、チューブを500 x gで4°Cで5分間遠心分離し、ピペッティングで上清を慎重に除去します。
8. ピペッティングで上下させて、市販の溶解バッファー2 5 mLで細胞をホモジナイズし、氷上で振とうしながら10分間インキュベートします。次に、チューブを500 x gで4°Cで5分間遠心分離し、ピペッティングで上清を慎重に除去します。
9. 1xプロテアーゼ阻害剤(それぞれ5 μLまたは1.4 μL)を含むせん断緩衝液1の500 μL(Jurkat細胞)または140 μL(患者サンプル)に細胞ペレットを再懸濁し、混合物を氷上で10分間インキュベートします。
10. クロマチン剪断の場合は、ステップ1.9の細胞懸濁液140μLをソニケーターチューブに移します(気泡の発生を避け、サンプル量のために必要に応じてこのステップを繰り返します)。7°Cの温度で集束超音波装置にチューブを置き、10分間(細胞株)または7.5分間(患者サンプル)で剪断し、平均入射電力9.375Wで200〜500bpのDNA断片を得る。
11. 最後に、小型遠心分離機で15700 x g、4°Cで10分間遠心分離し、上清を新しい1.5 mLチューブに回収します。
12. 適切なフラグメントサイズをテストするには、1.5% TBEアガロースゲル中のゲル電気泳動により、せん断したクロマチン20 μLを分析します。図2に、Jurkat細胞から採取された良質なクロマチンと悪い品質の剪断クロマチンの例示的な画像が示されています。この時点で、プロトコルが一時停止される可能性があります。せん断クロマチンは-80°Cで保存する必要があります。

結果

図1:SDS-PAGEおよびWestern-Blotで評価した固定Jurkat細胞における抗体性能の例(a)Jurkat細胞を0分間(バンドAおよびD)、2.5分間(バンドBおよびE)、または5分間(CおよびF)固定し、異なるメーカー(バンドA-C=メーカー1、バンドD-F=メーカー2)のαNFAT2抗体(クローン7A6)を比較しました。メーカー1の抗体は、固定されたサンプルに対しても高い親和性で結合し、全体的な性能が優れていました(バンドA-CとバンドD-Fを比較)。(b)異なるメーカーのαNFAT2抗体(クローンD15F1)を使用した。この抗体は、未固定のサンプル(バンドA)でのみ不良な性能を示し、エピトープは固定時にマスクされました。したがって、固定後に抗体の結...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
37 % ホルムアルデヒド p.a., ACS	ロス	4979.1
1×PBSの	シグマ・アルドリッチ	D8537
1.5 mLチューブシェーカー Themomixer comfort	エッペンドルフ	5355 000.011	同様の楽器で代用可能
M220集束超音波装置	コヴァリス	500295
20X Bolt MES SDS ランニングバッファ	サーモサイエンティフィック	B0002
トリス緩衝生理食塩水(TBS-10X)	細胞シグナル伝達	#12498
iBlot 2 ゲル転写デバイス	サーモサイエンティフィック	IB21001
iBlot 2 トランスファースタック、ニトロセルロース、レギュラーサイズ	サーモサイエンティフィック	B23001
大きな遠心分離機	エッペンドルフ	5804Rの	同様の楽器で代用可能
DNA LoBindチューブ 1.5 mL	エッペンドルフ	22431021
HALTプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル(100X)	サーモサイエンティフィック	78440
小型遠心分離機	サーモサイエンティフィック	ヘレウス フレスコ 17
密度勾配培地 Biocoll (密度 1,077 g/ml)	メルク	L 6115