クロマチン免疫沈降アッセイ:細胞内のタンパク質-DNA相互作用を研究する技術

要約

出典:Fuchs, A. R.,et al. A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、タンパク質-DNA相互作用を実証する古典的な手法であるクロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイのプロトコールについて説明しています。この技術は、ヒト慢性リンパ性白血病細胞の標的遺伝子を同定するために使用されます。

プロトコル

1. クロマチン免疫沈降

>注:クロマチン免疫沈降は、製造元の指示に従って市販のChIPキットを使用して行いました。

1. 免疫沈降の回数(70 μL(Jurkat細胞)または15 μL(患者サンプル)のせん断クロマチンと1つの抗体)を計算し、1.5 mLチューブに沈殿ごとに20 μLのプロテインAコーティングビーズを調製します。1回の沈殿につき40 μLの1x ChIPバッファー1でビーズをピペッティングして洗浄し、ビーズを磁気ラックで1分間休ませ、ピペッティングで上清を除去します。この手順を合計 4 回実行します。最終的に、ビーズを元のボリュームに1x ChIPバッファー1で再懸濁します。
2. 免疫沈降自体には、10 μgのαNFAT2抗体(7A6)を使用して、結合した標的配列とともにNFAT2を捕捉します。IgGコントロールとして2.5 μgのウサギIgG抗体(DA1E)を使用します。表1.
   に示すように、新鮮な1.5 mLチューブで反応液を調製します。 注:このプロトコールでは、固定中にエピトープがマスクされない高親和性を持つモノクローナル抗体を使用することが重要です。ポリクローナル抗体は、追加のレベルのばらつきをもたらし、受け取った結果を適切に解釈することを著しく困難にします。
3. ステップ1.2の混合物を、6rpmの回転ホイールで4°Cで一晩インキュベートします。
4. 翌日、小型遠心分離機でチューブを7,000 x gで5秒間回転させ、磁気ラックで1分間インキュベートし、吸引して上清を除去します。ビーズを洗浄バッファー1、2、3、4のそれぞれで1回連続して洗浄します。
5. これを行うには、ビーズを350 μLの洗浄バッファーに再懸濁し、回転ホイール(6 rpm)で4°Cで5分間インキュベー
トします。
6. その後、小型遠心分離機でチューブを7000 x gで5秒間回転させます。次に、磁気ラックに1分間置き、上清を取り除き、次の洗浄バッファーを追加します。
7. 最後の洗浄ステップの後、ピペッティングで上清を除去し、ビーズを溶出バッファー1の100 μLに取り込み、回転ホイール上で6 rpmで30分間インキュベー
トします。
8. チューブを短時間(小型遠心分離機で7000 x gで5秒)回転させ、磁気ラックに1分間置きます。
9. 次に、ピペッティングで上清を新しい1.5 mLチューブに移し、4 μLの溶出バッファー2を加えます。
10. インプットコントロールを作成するには、剪断したクロマチン 1 μL を 99 μL の溶出バッファー 1 と 4 μL の溶出バッファー 2 と混合します (このセットアップでは、患者ごとに 3 本のチューブがあります: 1 つのインプットコントロール、1 つの IgG コントロール、1 つの αNFAT2 サンプル)。
11. サンプルを1.5 mLチューブシェーカーで65 °C、1300 rpmで4時間インキュベートします。100 μL の 100% イソプロパノールを添加し、ボルテックスでサンプルを 7000 x g で 5 秒間遠心
分離します。
12. 利用可能な磁気ビーズを十分にボルテックスして再懸濁し、各サンプルに10 μLのビーズを加え、回転ホイール上で室温で6 rpmで1時間インキュベートします。
13. インキュベーション後、小型遠心分離機でチューブを7000 x gで5秒間回転させ、磁気ラックに1分間置きます。吸引によって上清を取り除きます。
14. ビーズを100 μLの洗浄バッファー1に再懸濁します。チューブを反転させて混合し、室温で6rpmの回転ホイールで5分間インキュベー
トします。
15. 小型遠心分離機でチューブを7000 x gで5秒間回転させ、磁気ラックに1分間置き、ピペッティングで上清を除去します。洗浄バッファー2を使用して手順2.13〜2.14を繰り返します。
16. 続いて、吸引により洗浄バッファーを除去し、ビーズを溶出バッファーの55μLに再懸濁し、回転ホイール上で室温で6rpmで15分間インキュベートして、沈殿したDNAを溶出させます。最後に、小型遠心分離機でチューブを7000 x gで5秒間回転させ、磁気ラックに1分間置き、上清を新しい1.5 mLチューブに移します
    手記：ここでは、プロトコルが一時停止される可能性があります。溶出したDNAは、その後、-20°Cで保存する必要があります。

名 名 名

アイテム	IPあたりの容量(μL)
5%BSAの	6
100 x プロテアーゼ阻害剤	3
5 x ChIPバッファ1	56
せん断クロマチン	x (15 μL または 70 μL)
プロテインAコーティング磁気ビーズ	20
ChIP seqグレードの水	185-x-y
抗体(αNFAT2またはIgGコントロール)	y (1.09 μL または 1 μL)
トータル	270

表1:クロマチン免疫沈降のピペッティングのスケジュール。クロマチン免疫沈降は、表に示されているように反応物を調製することによって行った。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗NFAT2抗体	アレクシス	1008505	クローン7A6
抗NFAT2抗体	細胞シグナル伝達	8032Sの	クローンD15F1
抗NFAT2抗体 ChIPグレード	アブカム	AB2796	クローン7A6
マグネティックラック DynaMag-15 マグネット	サーモサイエンティフィック	12301Dの	同様の楽器で代用可能
iDeal ChIp-seq キット for Histones	ダイアゲノード	C01010059
小型遠心分離機	サーモサイエンティフィック	ヘレウス フレスコ 17	同様の楽器で代用可能
シェーカーデュオマックス1030	ハイドルフ・インスツルメンツ	〒543-32205-00	同様の楽器で代用可能
HALTプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル(100X)	サーモサイエンティフィック	78440
IRDye 680LT ロバ抗ウサギ IgG (H + L)、0.5 mg	LI-CORバイオサイエンス	〒926-68023
IRDye 800CWヤギ抗マウスIgG(H + L)、0.1 mg	LI-CORバイオサイエンス	〒925-32210
DNA LoBindチューブ 1.5 mL	エッペンドルフ	22431021
FBSスーペリア	メルク	S0615
37 % ホルムアルデヒド p.a., ACS	ロス	4979.1
1×PBSの	シグマ・アルドリッチ	D8537
M220集束超音波装置	コヴァリス	500295
20X Bolt MES SDS ランニングバッファ	サーモサイエンティフィック	B0002
トリス緩衝生理食塩水(TBS-10X)	細胞シグナル伝達	#12498
iBlot 2 ゲル転写デバイス	サーモサイエンティフィック	IB21001
iBlot 2 トランスファースタック、ニトロセルロース、レギュラーサイズ	サーモサイエンティフィック	B23001
大きな遠心分離機	エッペンドルフ	5804Rの	同様の楽器で代用可能

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