骨髄穿刺:細胞形態を調べるための骨髄取得法

要約

出典:Cloos, J. et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、腸骨脊椎から骨髄を吸引する技術と、生検のための塗抹標本の準備について説明しています。この例では、急性骨髄性白血病(AML)患者から骨髄穿刺を行い、細胞を調べて、重要な予後バイオマーカーである測定可能な残存病変(MRD)を確認します。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 骨髄吸引とサンプル調製

1. 患者と材料の準備
   1. 16ゲージの針を使用して、10 mLシリンジ1つまたは2つに1%リドカインを満たします。針を21ゲージの針に交換します。
   2. 時計のガラスに5%EDTAを2滴垂らします。
   3. 塗抹標本の準備のためにスライドガラス(n = 15、患者の番号と日付が一貫しています)をセットアップします。
   4. 患者を側褥位に置きます。上後腸骨棘の位置を特定し、ペンで印を付けます.
      手記：一般に、上後腸骨棘は、片手の幅が腸骨稜の遠位に位置し、片手の幅が正中線の外側にあります。女性の場合、実際の背骨はもう少し横方向、一部の男性ではもう少し内側にある場合があります。
   5. 目的の生検領域から外側に向かって円を描くように、エタノール中のクロルヘキシジン0.5〜1%で皮膚を消毒します。
   6. 滅菌手袋のパッケージを開け、滅菌手袋を着用し、パッケージをテーブルの上に置いて滅菌フィールドを作成します。吸引針でパッケージを開き、滅菌フィールドに置きます。
   7. 皮膚と皮下組織に浸潤し、最後に骨膜に浸潤します。骨膜では、直径1cmの領域が麻酔されるようにリドカインを投与します
      手記：骨膜へのリドカインの適切な投与は、患者の快適さにとって最も重要な要素の1つです。.導入された針で目的の生検位置を軽くたたいて、骨膜が適切に麻酔されているかどうかをテストし、患者が痛みを感じているかどうかを尋ねます。注目すべきは、子供は全処置中に完全に麻酔をかけられることです。
   8. 吸引針(15 Ga x 2.8インチ)を手のひらと人差し指の近位端で保持します。この位置により、より適切に制御できます。
   9. 回転運動(回内/回外運動をすばやく交互に行う)で皮膚を腸骨脊椎に向けて針を導入し、針を後腸骨棘に接触させます。
   10. 針が骨膜の麻酔領域に導入されていることを確認してください;患者は圧力のみを感じ、痛みを感じるべきではありません。患者が痛みを感じる場合は、針の位置を変えるか、リドカインを追加で投与します。.
   11. 穏やかでしっかりとした圧力で、針を時計回りと反時計回りに交互に回転させながら進めます。骨髄腔への侵入は、一般に抵抗の減少によって検出されます。
   12. 針からスタイレットを取り外します。10mLの空の注射器を針に取り付けます。
   13. シリンジプランジャーを優しく引っ張って引き抜き、負圧を加えます。骨髄が吸引されているときに、けいれん感と痛みを感じる可能性があることを患者に警告します。.十分な骨髄棘が放出されない場合は、1回のクイックドローで別の吸引を行う必要があります。ほとんどの針状体は、最初のプルから得られる最初の1〜2mLにあります。サンプルの希釈を避けるために、1〜2mLのみを吸引します.
       手記：希釈すると血液希釈が起こり、MRDの結果を混乱させる可能性があります。
   14. シリンジを取り外し、スタイレットを吸引針に交換します。骨髄の一部を時計のグラスに排出し、残りをヘパリンでコーティングした8mLチューブに排出します
       手記：骨髄吸引液を検体チューブに入れた直後に各チューブを反転させ、適切な抗凝固を確保します。骨髄凝固は、多くの場合、不適切な材料の原因です。追加の骨髄を同じ場所から吸引することができますが、好ましくは、新しい吸引物が採取される前に針が5〜10mm進められます。好ましくは、挿入レベルごとに2回以下のドローを行う必要があります。チューブには、1回目、2回目、および/または連続した抽選を表す数字が増すようにマークしてください。最も関連性の高い診断分析には、最初の抽選を使用するのが一般的なルールです。
   15. あるいは、針を挿入場所から引っ込め、元の挿入場所から数ミリメートル離れた骨髄腔に再導入し、手順を繰り返します
       手記：重大な血液汚染を避けるために、1回のプルで1〜2mLを超えて吸引しないでください。
   16. 材料が必要なだけ繰り返します。特定の臨床研究プロトコルに十分な材料が吸引されたら、骨髄針を取り外してください.
       手記：骨髄吸引が遅い、または困難な場合は、抗凝固剤で事前にフラッシュされた注射器の使用が役立つ場合があります。蛇口が乾燥している場合は、この原稿の範囲外であるトレフィン生検を実施してください。

2. 形態学的検査のための塗抹標本の準備

1. 最適な形態学的評価を行うには、時計のガラスの吸引液から針状体を取り出し(プラスチック製のヘラなどを使用)、スライドガラスの上に置きます。
2. 別のスライドガラスを骨髄でスライドの上にそっと置き、圧力を避けてゆっくりとスライドさせます。
   手記：骨髄の棘が非常に大きい場合にのみ、わずかな圧力がかかることがあります。これにより、細胞の広がりの厚さが減少します。この手順は、検体チューブを取り扱うことができるアシスタントの助けから恩恵を受けます。患者番号と連続骨髄採取の番号をチューブに正確にラベル付けすることが重要です。
3. スライドを完全に乾かしてから、May Giemsa Grünwald染色を行います(材料の表を参照)。光学顕微鏡で形態を調べます(図1を参照).
   注:図1Aは、さまざまな機能細胞タイプからなる健康な骨髄の塗抹標本を示し、図1Bは主に白血病芽球のAML患者を示しています。残存白血病負荷をより適切に定義するためには、イムノフェノタイピングを実施する必要があります。

結果

図1:骨髄塗抹標本。A) 健康なドナーおよび B) AML 患者 (FAB 5 サブタイプ)。100倍の倍率で示したギムザ染色。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
メイ・ギムザ・グリュンヴァルト	メルク	1.01424.2500