HSPCクローンの培養と採取:シングルソーティングされたHSPCクローンの入手方法

要約

出典:Huber, A. R., et al. Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、骨髄からHSPCを分離し、蛍光活性化細胞選別技術を使用してHSPCを選別するプロトコルについて説明しています。これは、一重に選別されたHSPCを取得する方法です。これらの選別された細胞を培養してHSPCクローンを得ます。

プロトコル

1. HSPC の分離、ソート、およびカルチャ

1. 1–2 x 10⁷ 単核細胞で 350 x g で 5 分間スピンダウンし、50 μL の FACS バッファーに再懸濁します。細胞ペレットを100 μLの抗CD3染色溶液(FACSバッファー中の抗CD抗体の1:100希釈)に再懸濁します。細胞を微量遠心チューブに移します.
   注:>2 x 10⁷細胞でソーティングする場合は、それに応じて抗体ミックスとFACSバッファーの量を増やしてください。
2. 2x HSC染色ミックス50 μLを、表1に示すレシピに従って調製
します
3. 調製したHSC染色混合物に50μLの細胞溶液を混合し、細胞を室温(RT)で15分間、または氷上で1時間インキュベートして抗体が結合します。
4. 1 mLのFACSバッファーとペレットを350 x gで5分間遠心分離して加えて細胞を洗浄します。
5. 細胞を300 μLのFACSバッファーに再懸濁し、35 μmのセルストレーナーキャップ付き5 mLポリスチレンチューブで細胞懸濁液をろ過して、蛍光活性化セルソーティング(FACS)の前に細胞凝集物を除去します。
6. 100 ng/mL SCF、100 ng/mL Flt3、50 ng/mL TPO、10 ng/mL IL-3、20 ng/mL IL-6、および 100 ng/mL 抗生物質製剤を添加した 1x SFEM 培地からなる 25 mL の HSPC 培地を調製します(材料の表を参照)。
7. 384ウェルの細胞培養プレートに、各ウェルに75 μLのHSPC培地を入れます
   注:外側のウェル内の培地の蒸発を防ぐため、外側のウェルに75μLの滅菌水またはPBSを入れ、これらのウェルを細胞の選別に使用しないでください。
8. 1 つの HSPC のソート
   1. 未染色のコントロール(単体で選別したHSC)と染色したサンプルから10,000個の細胞に基づいて、HSPCソーティングのゲートを設定します。ゲートを設定する代表的な結果を図 1 に示します。線形のFSC高さとFSC面積の分数の周りにゲートを描画することにより、単一セルをゲートします。染色されていないコントロールフラクションを使用して、系統^フラクションのゲートを描画します。CD34⁺細胞のゲートを描き、CD38-CD45RA^-細胞の特定のゲートを設定することで、このサブセットをさらに特徴付けます。
   2. 384ウェルプレートをFACSマシンにロードし、単一細胞を選別します
      注:FACSマシンに該当する場合は、インデックスソートデータを保持するオプションをオンに切り替えて、ソートされたセルの再トレースを有効にします。
9. 単回選別されたHSCの培養
   1. 384ウェルプレートを加湿した37°Cインキュベーター(5% CO₂.
      )に直接移します 手記： 培養中の蒸発を防ぐため、384ウェル培養プレート(蓋付き)を透明なポリエチレンラップで包みます。
   2. 384ウェルプレートをインキュベーターに3〜4週間置いておいて、クローンが見えるまでお過ごしください。クローン培養の代表的な画像を図2に示します。投入材料の条件にもよりますが、選別された細胞の5%〜30%がクローン性に増殖します。

の の

抗体	容量 [μL]
BV421 - CD34	5
FITC-リネージュミックス(CD3/14/19/20/56)	5
PE-CD38	2
APC- CD90	0.5
PerCP/Cy5.5 - CD45RA	5
PE / Cy7-CD49f	1
FITC -CD16	1
FITC-CD11	5
FACSバッファ	25.5

>表1:HSCソーティングミックス。HSCの選別に用いた抗体の希釈率を示す表を示します。

2. HSPCクローンの収集

1. 4週間の培養後、どのウェルの合流度が30%以上であるかを判断します。
2. 1.5 mLマイクロチューブにPBS中の1 mLの1% BSAを事前に充填し(各クローン増殖について)、対応するウェルに従ってチューブを標識します。
3. ピペットチップに付着する細胞の数を最小限に抑えるために、PBS中の1% BSAでピペットチップを事前に濡らします。
4. 200μLピペット(75μLに設定)でウェル内の培地を激しく(少なくとも5回)ピペットで上下させ、ウェルの底をこすり落とすとウェル内の細胞が緩み、ウェルに対応する標識マイクロチューブに細胞懸濁液を回収します。
5. PBS中の新鮮な1% BSAを75 μL取り、ウェル内でピペッティングを繰り返して、細胞の取り込みを最大化します
   注:クローン培養細胞はウェルの底にくっつくことがあります。標準的な倒立型光学顕微鏡を使用してウェルを検査し、すべての細胞が収集されたかどうかを確認します。
6. >30%のコンフルエントを持つすべてのウェルが回収された場合は、384ウェルプレートをインキュベーターに戻します。クローン培養物は最大5週間増殖する可能性があります。
7. 細胞懸濁液を350 x gで5分間スピンダウンします。小さなペレットが見えているはずです。
8. 約5μLの上清を除くすべての上清を慎重に取り除きます。細胞ペレットは-20°Cで凍結し、DNA単離の前に数ヶ月間保存することができます。

結果

図1:投入材料に基づく実験手順を示すフローチャート。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:セルソーティング戦略。まず、ゲーティングは小さな単核細胞で行われます。次に、単一のセルは線形分数の選択によってゲートされます。系統陰性細胞はゲートされます。すべてのCD34⁺

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CD11c FITC	バイオレジェンド	301603	クローン3.9
CD16 FITC	バイオレジェンド	302005	クローン3G8
CD3 BV650	バイオレジェンド	300467	クローン UCHT1
CD34 BV421	バイオレジェンド	343609	561
CD38 PE	バイオレジェンド	303505	クローンHIT2
CD45RA PerCP/Cy5.5	バイオレジェンド	304121	クローンHI100
CD49f PE/Cy7	バイオレジェンド	313621	GoH3のクローン
CD90 APCの	バイオレジェンド	328113	クローン5E10
セルストレーナー5mLチューブ	コーニング	352235
CELLSTARプレート、384w、130 μL、F底、TC、カバー	グライナー	781182
ヒトFLT3-リガンド、プレミアムグレード	ミルテニーバイオテック	〒130-096-479	PBS中の0.1% BSA中の100 μg/mLのシングルユースアリコート(25 μL)中のレコンシスティチュレート
ヒト組換えIL-3(大腸菌発現)	幹細胞技術	78040.1	PBS中の0.1% BSA中の100 μg/mLのシングルユースアリコート(2.5 μL)でレコンシスチチュレート
ヒト組換えIL-6(大腸菌発現)	幹細胞技術	78050.1	PBS 中 0.1% BSA 中の 100 μg/mL のシングルユースアリコート (5 μL) でレコンシスチチュレート
ヒトSCF、プレミアムグレード	ミルテニーバイオテック	〒130-096-695	PBS中の0.1% BSA中の100 μg/mLのシングルユースアリコート(25 μL)中のレコンシスティチュレート
ヒューマンTPO、プレミアムグレード	ミルテニーバイオテック	〒130-095-752	PBS 中 0.1% BSA 中の 100 μg/mL のシングルユースアリコート (12.5 μL) 中のレコンシスチチュレート
リネージュ (CD3/14/19/20/56) FITC	バイオレジェンド	348701	クローン:UCHT1、HCD14、HIB19、2H7、HCD56
PBSの			研究所の施設で作られています。市販のPBSも使用できます
プリモシン	インビボゲン	アリ-PM-1	抗生物質製剤

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