出典:Huber, A. R., et al. Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood. J. Vis. Exp. (2019).
このビデオでは、骨髄からHSPCを分離し、蛍光活性化細胞選別技術を使用してHSPCを選別するプロトコルについて説明しています。これは、一重に選別されたHSPCを取得する方法です。これらの選別された細胞を培養してHSPCクローンを得ます。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
HSPCクローンの培養と採取:シングルソーティングされたHSPCクローンの入手方法
1.1K 回視聴
⸱
2023年4月30日
この記事について
要約
プロトコル
1. HSPC の分離、ソート、およびカルチャ
- 1–2 x 107 単核細胞で 350 x g で 5 分間スピンダウンし、50 μL の FACS バッファーに再懸濁します。細胞ペレットを100 μLの抗CD3染色溶液(FACSバッファー中の抗CD抗体の1:100希釈)に再懸濁します。細胞を微量遠心チューブに移します.
注:>2 x 107細胞でソーティングする場合は、それに応じて抗体ミックスとFACSバッファーの量を増やしてください。 - 2x HSC染色ミックス50 μLを、表1に示すレシピに従って調製 します
- 調製したHSC染色混合物に50μLの細胞溶液を混合し、細胞を室温(RT)で15分間、または氷上で1時間インキュベートして抗体が結合します。
- 1 mLのFACSバッファーとペレットを350 x gで5分間遠心分離して加えて細胞を洗浄します。
- 細胞を300 μLのFACSバッファーに再懸濁し、35 μmのセルストレーナーキャップ付き5 mLポリスチレンチューブで細胞懸濁液をろ過して、蛍光活性化セルソーティング(FACS)の前に細胞凝集物を除去します。
- 100 ng/mL SCF、100 ng/mL Flt3、50 ng/mL TPO、10 ng/....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
図1:投入材料に基づく実験手順を示すフローチャート。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:セルソーティング戦略。まず、ゲーティングは小さな単核細胞で行われます。次に、単一のセルは線形分数の選択によってゲートされます。系統陰性細胞はゲートされます。すべてのCD34+
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| CD11c FITC | バイオレジェンド | 301603 | クローン3.9 |
| CD16 FITC | バイオレジェンド | 302005 | クローン3G8 |
| CD3 BV650 | バイオレジェンド | 300467 | クローン UCHT1 |
| CD34 BV421 | バイオレジェンド | 343609 | 561 |
| CD38 PE | バイオレジェンド | 303505 | クローンHIT2 |
| CD45RA PerCP/Cy5.5 | バイオレジェンド | 304121 | クローンHI100 |
| CD49f PE/Cy7 | バイオレジェンド | 313621 | GoH3のクローン |
| CD90 APCの | バイオレジェンド | 328113 | クローン5E10 |
| セルストレーナー5mLチューブ | コーニング | 352235 | |
| CELLSTARプレート、384w、130 μL、F底、TC、カバー | グライナー | 781182 | |
| ヒトFLT3-リガンド、プレミアムグレード | ミルテニーバイオテック | 〒130-096-479 | PBS中の0.1% BSA中の100 μg/mLのシングルユースアリコート(25 μL)中のレコンシスティチュレート |
| ヒト組換えIL-3(大腸菌発現) | 幹細胞技術 | 78040.1 | PBS中の0.1% BSA中の100 μg/mLのシングルユースアリコート(2.5 μL)でレコンシスチチュレート |
| ヒト組換えIL-6(大腸菌発現) | 幹細胞技術 | 78050.1 | PBS 中 0.1% BSA 中の 100 μg/mL のシングルユースアリコート (5 μL) でレコンシスチチュレート |
| ヒトSCF、プレミアムグレード | ミルテニーバイオテック | 〒130-096-695 | PBS中の0.1% BSA中の100 μg/mLのシングルユースアリコート(25 μL)中のレコンシスティチュレート |
| ヒューマンTPO、プレミアムグレード | ミルテニーバイオテック | 〒130-095-752 | PBS 中 0.1% BSA 中の 100 μg/mL のシングルユースアリコート (12.5 μL) 中のレコンシスチチュレート |
| リネージュ (CD3/14/19/20/56) FITC | バイオレジェンド | 348701 | クローン:UCHT1、HCD14、HIB19、2H7、HCD56 |
| PBSの | 研究所の施設で作られています。市販のPBSも使用できます | ||
| プリモシン | インビボゲン | アリ-PM-1 | 抗生物質製剤 |
