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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
骨髄からのc-Kit +細胞の単離
- 機関のガイドラインに従ってマウスを犠牲にしてください.
注:ここでは、マウスをAVMA推奨流量に従って二酸化炭素(CO2)に曝露し、呼吸と心拍の停止によって死亡が決定され、その後に子宮頸部脱臼が 続くまで観察しました。
- マウスから脚の骨を採取します—2つの大腿骨、2つの脛骨、2つの腸骨。メスでこすり落とし、骨からすべての組織を取り除きます。脚の骨を氷の上の冷たい1x PBSに入れます—15mLのチューブに5mLを入れます。チューブの中身を乳鉢に注ぎ、乳棒で粉砕します。
- ピペットを使用して、70 μmの細胞ストレーナーで細胞懸濁液を10 mLピペットを取り付けた50 mLスクリューキャップチューブにろ過します。乳鉢と乳棒を冷たい1x PBSで複数回洗浄し、細胞懸濁液を集めて50mLチューブに加えます。骨髄を1,200 x g、4°Cで5分間スピンダウンします。ガラスピペットを取り付けた真空で上清を取り除きます。ピペットで細胞ペレットを1x PBSの5 mLに懸濁します。
- ピペットを使用して、界面を乱さないように細心の注意を払いながら、室温(温度が重要です)の5mLのポリスクロースの上部に懸濁骨髄をゆっくりと加えます。ブレーキを切った状態で、室温で400 x gで20分間回転させます。
- 曇った全単核細胞(TMNC)界面をピペットで収集し、新しい15 mLチューブに入れます。1x PBSで洗浄用として容量を最大10 mLにし、計数用に20 μLを取り、1,200 x g、4°Cで5分間遠心します。上清を捨て、ステップ4.6.1のためにペレットを氷上に保存します。
- c-Kit+細胞単離を行います。
- マイクロビーズキットのプロトコルに従って、c-Kit+細胞を単離してください。細胞ペレットを1x PBS + EDTA + BSAの80 μLに再懸濁し、10 7個の細胞に添加します。細胞懸濁液に、20 μL の CD117 MicroBeads/107 total cells を加えます。ボルテックスでよく混合し、4°Cで10分間インキュベートし、1x PBS + EDTA + BSAを加えて容量を最大10 mLにし、1,200 x g、4°Cで5分間遠心します。
- 上清を真空で除去し、細胞ペレットを500 μL/10 8 total cells in 1x PBS + EDTA + BSAで懸濁します。磁気カラムを取り付けたマグネットスタンドを使用して、1x PBS + EDTA + BSAを3 mL加え、重力を介して15 mLの収集チューブに流します。
- 最初のバッファー添加物がカラムを通過し終えたら、細胞懸濁液をカラムに添加し、重力を介して15 mLコレクションチューブに流入させます。このフロースルーは、望ましくないセル分画です。
- カラムを3 mL 1x PBS + EDTA + BSAで毎回3回洗浄し、重力を介して収集チューブに流入させます。カラムをマグネットから取り出し、15 mLチューブの上部に置きます。
- 1x PBS + EDTA + BSA を 5 mL 加え、カラムに付属のプランジャーですぐにフラッシュします。プランジャーを取り外し、さらに5mLの1x PBS + EDTA + BSAでフラッシュを繰り返します。標準的な方法を使用して、総体積のセルをカウントします。
- 細胞を1,200 x g、4°Cで5分間スピンダウンし、上清を除去し、ペレットを完全なIMDM(IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] + mSCF [50 ng/mL] + FLT3リガンド [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL])に再懸濁して培養します。これらの細胞を2 x 106細胞/1 mLの細胞IMDM完全培地で一晩培養し、37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに入れます。