磁気活性化細胞ソーティング:c-kit陽性細胞を単離する方法

要約

出典:Kesarwani, M., et al. Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、マウスの骨髄からc-kit陽性細胞を単離する技術について説明しています。このプロトコルでは、トランスジェニックマウスからc-kit陽性細胞を単離し、c-FosとDusp1を単独または一緒に白血病の薬物標的として検証します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

骨髄からのc-Kit ⁺細胞の単離

1. 機関のガイドラインに従ってマウスを犠牲にしてください.
   注:ここでは、マウスをAVMA推奨流量に従って二酸化炭素(CO₂)に曝露し、呼吸と心拍の停止によって死亡が決定され、その後に子宮頸部脱臼が
続くまで観察しました。
2. マウスから脚の骨を採取します—2つの大腿骨、2つの脛骨、2つの腸骨。メスでこすり落とし、骨からすべての組織を取り除きます。脚の骨を氷の上の冷たい1x PBSに入れます—15mLのチューブに5mLを入れます。チューブの中身を乳鉢に注ぎ、乳棒で粉砕します。
3. ピペットを使用して、70 μmの細胞ストレーナーで細胞懸濁液を10 mLピペットを取り付けた50 mLスクリューキャップチューブにろ過します。乳鉢と乳棒を冷たい1x PBSで複数回洗浄し、細胞懸濁液を集めて50mLチューブに加えます。骨髄を1,200 x g、4°Cで5分間スピンダウンします。ガラスピペットを取り付けた真空で上清を取り除きます。ピペットで細胞ペレットを1x PBSの5 mLに懸濁します。
4. ピペットを使用して、界面を乱さないように細心の注意を払いながら、室温(温度が重要です)の5mLのポリスクロースの上部に懸濁骨髄をゆっくりと加えます。ブレーキを切った状態で、室温で400 x gで20分間回転させます。
5. 曇った全単核細胞(TMNC)界面をピペットで収集し、新しい15 mLチューブに入れます。1x PBSで洗浄用として容量を最大10 mLにし、計数用に20 μLを取り、1,200 x g、4°Cで5分間遠心します。上清を捨て、ステップ4.6.1のためにペレットを氷上に保存します。
6. c-Kit⁺細胞単離を行います。
   1. マイクロビーズキットのプロトコルに従って、c-Kit⁺細胞を単離してください。細胞ペレットを1x PBS + EDTA + BSAの80 μLに再懸濁し、^{10 7}個の細胞に添加します。細胞懸濁液に、20 μL の CD117 MicroBeads/10⁷ total cells を加えます。ボルテックスでよく混合し、4°Cで10分間インキュベートし、1x PBS + EDTA + BSAを加えて容量を最大10 mLにし、1,200 x g、4°Cで5分間遠心します。
   2. 上清を真空で除去し、細胞ペレットを500 μL/10 8 total cells in 1x PBS + EDTA + BSAで懸濁します。磁気カラムを取り付けたマグネットスタンドを使用して、1x PBS + EDTA + BSAを3 mL加え、重力を介して15 mLの収集チューブに流します。
   3. 最初のバッファー添加物がカラムを通過し終えたら、細胞懸濁液をカラムに添加し、重力を介して15 mLコレクションチューブに流入させます。このフロースルーは、望ましくないセル分画です。
   4. カラムを3 mL 1x PBS + EDTA + BSAで毎回3回洗浄し、重力を介して収集チューブに流入させます。カラムをマグネットから取り出し、15 mLチューブの上部に置きます。
   5. 1x PBS + EDTA + BSA を 5 mL 加え、カラムに付属のプランジャーですぐにフラッシュします。プランジャーを取り外し、さらに5mLの1x PBS + EDTA + BSAでフラッシュを繰り返します。標準的な方法を使用して、総体積のセルをカウントします。
   6. 細胞を1,200 x g、4°Cで5分間スピンダウンし、上清を除去し、ペレットを完全なIMDM(IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] + mSCF [50 ng/mL] + FLT3リガンド [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL])に再懸濁して培養します。これらの細胞を2 x 10⁶細胞/1 mLの細胞IMDM完全培地で一晩培養し、37°Cおよび5%_CO2のインキュベーターに入れます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
生体材料
IMDM	セルグロ(コーニング)	15-016-CVRの
組換えマウスSCF	プロスペック	CYT-275
組換えマウスFLT3-リガンド	プロスペック	CYT-340
組換えマウスIL-6	プロスペック	CYT-350
組換えマウスIL-7	ペプロテック	217-17
FBSの	アトランタバイオロジカル	S11150
PBSの	コーニング	21040履歴書
70 μm ナイロンセルスターライナー	ベクトン・ディキンソン	352350
LSカラム	ミルテニー	〒130-042-401
EDTAの	アンビオン	AM9261
BSAの	シグマ	A7906
乳鉾	クアテック	60316 および 60317
CD117マイクロビーズキット	ミルテニー	〒130-091-224
マグネットスタンド	ミルテニー

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