レトロウイルス媒介形質導入:がん細胞に標的遺伝子を導入する方法

要約

出典:Kesarwani, M., et al. Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、慢性骨髄性白血病細胞株のレトロウイルスを使用して標的遺伝子を移植することにより、遺伝子検証のプロトコルについて説明しています。レトロウイルスは、形質導入と呼ばれるプロセスを通じて遺伝物質を白血病細胞に移植するメディエーターとして機能し、標的遺伝子の長期発現を可能にします。この方法は、遺伝子検証と治療開発のために、任意の標的細胞に適用できます。

プロトコル

1. 変換

1. レトロウイルスプラスミドトランスフェクション
   1. HEK293細胞を前日の午後に37°Cに設定した水浴で新たに解凍し、HEK細胞を含むクライオチューブを室温で435 x gで室温で3分間回転させ、上清を真空で除去し、10% FBS、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびグルタミンを添加したDMEM1 mLに細胞ペレットを懸濁します。
   2. 細胞を数え、10 cmの処理済み皿(~4 x 10⁶ HEK293T細胞)に適切な容量を加えます。14 mLのDMEM 10培地を皿に加え、上下にスライドさせて均等に分散させてよく混ぜます。ディッシュを37°C、5%CO₂インキュベーターに一晩置きます。
   3. 翌朝、倒立型光学顕微鏡(50%以上が良好)で細胞の合流を確認します。
   4. DNA(所望のレトロウイルスプラスミド)、PclEco(パッケージングプラスミド)、2 M CaCl₂、およびH₂0を1.5 mLチューブ(= 500 μL)にマイクロピペットで混合し、7.5 μgのDNA(BCR-ABL1-YFP)、7.5 μgのpCLeco、62 μLの2 M CaCl₂、および水を最終容量500 μLにします。さらに1.5 mLのチューブに2x HBSの500 μLを加えます。
   5. 2x HBS(280 mM NaCl、100 mM HEPES、および1.5 mM Na₂HPO₄)500 μLが入った1.5 mLチューブにDNAミックスを滴下しながら、混合します。これを実現するには、ボルテックスを最低速度に設定し、トランスフェクションミックスを加えながらHBSチューブをその上に保持して一定に混合します。
   6. トランスフェクションミックスを室温で20〜30分間インキュベートします。インキュベーション中に、25 nMクロロキンをHEK細胞に加え、インキュベーターに戻します。インキュベーション後、トランスフェクションミックスをHEK細胞に滴下し、培地を穏やかに撹拌してトランスフェクションミックスをプレート全体に混合します。
   7. 混合物と混合した細胞を、37°C、5%_CO2インキュベーターで~8時間インキュベートします。これらの細胞の培地を、14 mL の新鮮な DMEM 10 培地を非常にゆっくりと加えて交換します。ディッシュの壁に対してゆっくりとピペッティングすることで、HEK細胞の剥離を防ぐことができます。細胞を37°C、5%_CO2インキュベーターで一晩インキュベートします。
   8. 10mLのシリンジでウイルス上清を採取し、上清をシリンジに引き込み、0.45μmシリンジフィルターを取り付けます。ウイルス上清を新しい収集チューブに沈めます。~16時間後にウイルス上清の最初のコレクションを取ります。
2. フィブロネクチンウイルスの濃度と形質導入
   1. 0.1 mgの組換えヒトフィブロネクチンフラグメントを1x PBS中に2 mL加え、未処理の6ウェル培養プレートに添加します。必要なだけフィブロネクチンを調製しますが、これは細胞の数と遺伝子型によって異なります。1つのウェルで1,000万個のc-Kit+細胞を十分に形質導入できます。プレートを4°Cで一晩インキュベートします。
   2. 翌日、ピペットでウェルからフィブロネクチンを取り出し、滅菌した2% BSAを1x PBS中に2 mL分滴で注入してプレートをブロックし、室温で30分間インキュベートします。BSAを真空で取り出し、1x PBSを2 mLピペッティングして完全に洗浄し、真空で取り出します。
   3. 新たに収集してろ過したウイルス上清(0.45 μm)を直ちに5 mLまで加えます。435 x g、32°C、2時間遠心分離します。真空で上清を取り除き、新たに採取したウイルス上清を追加してこの手順を繰り返し、再度回転させます。上清を真空で取り除き、1x PBSを2mL加えてウェルを洗浄します。その後、掃除機で取り除きます。
   細胞を
   4. スピンダウンし、ペレットを完全なIMDMに再懸濁して一晩培養したc-Kit +マウス細胞を添加し、培養します。これらの細胞を2 x 10⁶細胞/1 mLの細胞IMDM完全培地で一晩培養し、37°Cおよび5%CO₂)のインキュベーターにウイルス被覆ウェルに入れ、細胞懸濁液をよく混合し、ウイルス濃縮フィブロネクチンプレートにピペッティングします。1,200 x g、25°C、90分間遠心します。細胞を37°C、5%CO2インキュベーターに入れます。
   5. 形質導入後48時間後、1,200 x g、4°Cで5分間遠心分離して細胞をペレット化し、FACSバッファー#1 (1x PBS + 0.5% BSA) で6 x 10⁶/mLに再懸濁します。フローサイトメトリーを使用してYFP陽性の割合を測定することにより、BCR-ABL1陽性細胞の割合を決定します。
   6. 標準の手順でイベントを取得します。まず、前方散乱と側方散乱に基づいて生細胞をゲートします。次に、ネガティブコントロールによって決定されたYFP陰性細胞を除くYFP陽性生細胞をゲートします(図1)。

結果

図1:移植マウスとWTマウスの血液からのYFP+細胞の頻度を示すFACS(ネガティブコントロール)。上部のパネルには、セルとゲーティングの散布図が表示されます。下のパネルは、YFPと側方散乱光のヒストグラムを示しています。MFIが>10³の細胞をYFP+とみなした。形質導入後の骨髄細胞についても、形質導入の割合を計算するために同様のゲーティングを用いた。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	セルグロ(コーニング)	15-013-履歴書
レトロネクチン組換えヒトフィブロネクチンフラグメント	タカラ	T100Bの
FBSの	アトランタバイオロジカル	S11150
ペンシルベニア州/連鎖球菌	セルグロ(コーニング)	30-002-CIの
L-グルタミン	セルグロ(コーニング)	25-005-CL	水に5 mg/mLのストック
ヘープス	シグマ	H7006-J
PBSの	コーニング	21040履歴書
Na2HPO4.7H2O	シグマ	S9390
塩化カルシウム	インビトゲン	K278001
2x HBSの	インビトゲン	K278002
EDTAの	アンビオン	AM9261
BSAの	シグマ	A7906
ヒト長期培養開始細胞アッセイ	Stempセルテクノロジー
TC-10 自動セルカウンター	バイオラッド
ROSACreERT2 / c-Fos fl / fl Dusp1 - / -	自社製
ROSACreERT2/c-Fosfl/FL	自社製
ROSACreERT2	ジャクソン研究所
C57BL/6	ジャクソン研究所
CML-CD34+および正常CD34+細胞	シンシナティ大学医学部附属病院
LSR II(FACS アナライザー)	BDの
フォルテッサI(FACSアナライザー)	BDの
FACSAriaII(FACSソーター)	BDの
NAPCOシリーズ8000WJCO2インキュベーター	サーモサイエンティフィック
スイングバケットローターセトリフュージ5810R	エッペンドルフ
1/2 cc Lo-Dose u-100 インスリン注射器 28 G1/2	ベクトン・ディキンソン	ベクトン・ディキンソン
ヒドロコルチゾン半琥珠酸ナトリウム	幹細胞技術	7904
GM-CSFの	プロスペック	CYT-221
G-SCFの	プロスペック	CYT-220
ヒトIL-3	プロスペック	CYT-210
ヒトSCF	プロスペック	CYT-255
エリスロポエイン	アムジェン社	5513-267-10
BD Perm/Wash(リン酸化流動用透過・洗浄液)	BDの	554723
BD Cytofix/Cytoperm(固定・透過化液)	BDの	554714
BDファームリセ	BDの	555899
70 μm ナイロンセルスターライナー	ベクトン・ディキンソン	352350
0.45 μM アクロディスクフィルター	バケツ	2016年10月

の シリーズ の の 名