メチルセルロースベースのCFUアッセイ:白血病細胞のコロニー形成に対する抗癌化合物の影響を決定する方法

要約

出典:Kesarwani, M., et al. Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、抗がん剤による治療に応答して白血病細胞によって形成されるコロニーの数を特定し、カウントするのに役立つメチルセルロースベースのコロニー形成ユニットまたはCFUアッセイのプロトコルについて説明しています。

プロトコル

1. コロニー形成ユニットアッセイ

1. メチルセルロースをマウスのサイトカインで室温で1〜2時間解凍し、針なしの5mLシリンジを使用してFACSチューブにメチルセルロース3mLをアリコートします。YFP陽性細胞をセルソーターで選別します。
2. 細胞をスピンダウンし、ペレットをIMDMコンプリート培地に懸濁します。プレーティングする細胞をカウントし、希釈して、100 μLのIMDM完全培地中に5,000個のYFP陽性細胞を得ます。
3. 5,000個のYFP陽性細胞と適切な阻害剤を含む細胞懸濁液100 μLを3 mLのメチルセルロースに加えます。渦を上にして10〜30秒間混合します。
4. ほとんどの気泡が逃げた後、1mLシリンジを使用して、片側のメディアを3つの反復3cmプレートに1mLのメディアをプレートし、プレートを円を描くようにゆっくりと傾けて均等に広がります。
5. 使用する阻害剤の最終濃度は、イマチニブが3 μM、DFCが0.2 μM、BCIが0.5 μMで、単独または組み合わせて投与されます。必要に応じて、メチルセルロースに添加した4-ヒドロキシタモキシフェン(1 μg/mL)を細胞に播種して、c-Fosを除去します。
6. メッキ後、プレートを大きなシャーレに入れ、真ん中に2mLの滅菌水が入ったオープンディッシュを1つ入れます。大きなシャーレに蓋をして、37°C、5%CO₂インキュベーターで慎重にインキュベートします。顕微鏡下でコロニーの総数を数えて、プレーティングの1週間後にコロニー数を記録します。
7. PCRによるc-Fos欠失のための適切なプレートからいくつかのコロニーを分析します。P1000チップでコロニーを吸い込んでコロニーを収集します。1x PBSの500 μL中の細胞を、PBSのチップを複数回洗浄して取り除きます。細胞懸濁液を6,000 x gで1分間遠心し、ゲノムDNA単離キットを使用して細胞ペレットからDNAを抽出します。
8. このゲノムDNAをプライマーmFos-FP3およびmFos-RP5を用いてPCRに用います。2% アガロースゲルで PCR 産物を解析し、ゲルドキュメンテーションシステムを使用して画像化します。
9. コロニーをグラフィックで表示するには、塩化ヨードニトロテトラゾリウムを使用してコロニーを染色します。10 mgの塩化ヨードニトロテトラゾリウムを10 mLの水に溶解して、1 mg / mL溶液を得ます。.10 mLシリンジに0.2 μmフィルターを取り付けたルアーロックを使用して、組織培養フード内の滅菌条件下で溶液をフィルター滅菌します。
10. 組織培養フードに、100 μLの染色液をCFUプレートの周囲に滴下し、コロニーをスライドさせたり乱したりしないように注意してください。プレートを37°C、5%CO₂細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートします。コロニーは暗赤褐色に変わります。無菌組織培養フードの白い背景を使用して、染色されたCFUプレートの写真を撮ります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
IMDM	セルグロ(コーニング)	15-016-CVRの
MethoCult GF M3434 (マウスCFU用メチルセルロース)	幹細胞	3434
4-ヒドロキシタモキシフェン	シグマ	H6278-J
組換えマウスSCF	プロスペック	CYT-275
組換えマウスFLT3-リガンド	プロスペック	CYT-340
組換えマウスIL-6	プロスペック	CYT-350
組換えマウスIL-7	ペプロテック	217-17
ディフシー	LKTラボラトリーズ株式会社	D3420
BCIの	ケムゾンサイエンティフィック	NZ-06-195
イマチニブ	LCラボレーター	I-5508
1x PBSの	セルグロ(コーニング)	21-040-履歴書
1/2 cc Lo-Dose u-100 インスリン注射器 28 G1/2	ベクトン・ディキンソン	329461
ヨードニトロテトラゾリウムクロリド	シグマ	I10406
楽器
NAPCOシリーズ8000WJCO2インキュベーター	サーモサイエンティフィック
スイングバケットローターセトリフュージ5810R	エッペンドルフ
C-1000 サーマルサイクラー	バイオラッド
ChemiDoc Imaging System(ゲルおよびウェスタンブロット用イメージングシステム)	バイオラッド	17001401
マウス
ROSACreERT2	ジャクソン研究所
ROSACreERT2/c-Fos fl/FL Dusp1-/	自社製
ROSACreERT2/c-Fosfl/FL	自社製