ネガティブ免疫磁気選択:末梢血単核細胞からB細胞を精製する方法

要約

出典: Serra S. et al. HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、免疫磁気ターゲティングと末梢血単核細胞懸濁液からの分離によってB細胞を精製する方法を説明しています。この方法では、特定の細胞表面タンパク質を標的とする特異的な抗体またはリガンド(磁性粒子に結合)で不要な細胞タイプを標識し、磁気分離によって不均一な細胞懸濁液から枯渇させます。

プロトコル

1. ネガティブ単離による白血病B細胞の精製

1. PBS 0.1 % ウシ血清アルブミン (BSA) 2 mM EDTA、pH 7.4 (単離バッファー) に 10^{個 7} PBMC/ml を再懸濁します。
2. 10 μgのマウスモノクローナル抗CD3、-CD14、-CD16一次抗体を10 7細胞に添加し、4°Cで30分間インキュベー
トします。
3. 細胞をアイソレーションバッファーで洗浄し、500 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
4. 細胞を分離バッファーに10⁷ PBMC/mlで再懸濁します。
5. 細胞とインキュベートする前に、ヒツジの抗マウスIgG磁気ビーズをバイアルに再懸濁します。10⁷細胞あたり100 μlのビーズをチューブに移します。
6. 1 mLのアイソレーションバッファーを加え、チューブをマグネットホルダーに1分間置き、上清を5 mLのピペットで捨てます。
7. チューブを磁石から取り外し、洗浄したビーズを100 μlのアイソレーションバッファーに再懸濁します。
8. 10⁷細胞を100 μlの磁気ビーズで30分間、4°Cで静かに傾けて回転させながらインキュベー
トします。
9. チューブをマグネットホルダーに2分間置き、CD19⁺/CD5⁺未結合細胞を含む上清を5 mLピペットで新しいチューブに移します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
人間の血液
精製抗CD3、-CD14、-CD16	自社製		マウスモノクローナル
Dynabeads ヒツジ抗マウス IgG	インビトゲン	11031
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	アムレスコ	E404-200タブ	錠剤
ウシ血清アルブミン(BSA)	IDバイオ	1000〜70	標準グレード
アイソレーションバッファ			PBS 0.1% BSA 2 mM EDTA、pH 7.4
DynaMag-15マグネット	インビトゲン	12301Dの	ダイナル磁気ビーズセパレーター