細胞外プリン代謝:白血病細胞におけるアデノシン生成と代謝を測定するためのHPLCベースのアッセイ

要約

出典: Serra S et al. HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、白血病がん細胞の細胞外環境におけるAMPの消費によって生成されるアデノシンおよび関連プリンの代謝を測定するための定量的逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)法について説明しています。このプロトコールは、異なる培養条件下で精製された慢性リンパ性白血病(CLL)細胞によって産生される細胞外プリンヌクレオチドおよびヌクレオシドの定量のために開発および検証された、感度、特異性、信頼性、再現性のあるRP-HPLCアッセイについて説明しています。

プロトコル

1. 標準液と阻害剤原液の調製

1. AMPを調製するには、0.00345 gのAMPを秤量し、5 mLの無血清培地に溶解して、AMPの2 mM標準溶液を得ます。
2. ADOを調製するには、0.00265 gのADOを秤量し、5 mLの無血清培地に溶解して、ADOの2 mM標準溶液を得ます。
3. INOを調製するには、0.00268 gのINOを秤量し、5 mLの無血清培地に溶解して、2 mMのINO標準溶液を得ます。
4. AMP、ADO、INOの400 μM溶液を調製し、2 mMストック溶液1 mLを4 mLの無血清培地(最終容量5 mL)に混合します。
   1. 400 μMの標準溶液500 μlを1,500 μLの無血清培地(最終容量2 mL)にピペッティングして、各400 μM標準溶液を1:4に希釈して100 μMの濃度を得ます。
   2. 無血清培地で各化合物の段階希釈液を調製して、次の濃度を得ます:100 μM - 50 μM - 25 μM - 10 μM - 5 μM - 2.5 μM - 1 μM - 0.5 μM - 0.25 μM.
      注:例えば、100 μM 溶液 1 ml を 1 mL の無血清培地 (1:2 希釈) にピペットで移して 50 μM の濃度を取得し、残りの希釈に進みます。
5. PBSに溶解したAPCPの10 mMストック溶液を調製し、アリコートして-30°Cでストックします。
6. EHNA塩酸塩、dCF、およびジピリダモールをジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した10 mMのストック溶液を調製し、アリコートして-30°Cでストックします。

2. HPLCメソッドのプログラミング

1. 0.770 gの酢酸アンモニウムを2 Lの二重脱イオン水(緩衝液A)に溶解して、7 mM酢酸アンモニウム緩衝液を調製します。塩酸でpH3.0に調整します。
2. HPLC(Buffer B)用の超高純度アセトニトリルを2L以上入れたガラス瓶を調製し、ガードカラムとカラムをHPLCに接続します
   注: カラムとバッファーは、使用中は RT 状態です。
3. HPLCソフトウェアにログインし、「プロジェクトの参照」ボタンを選択します。「ファイル」メニューに移動し、「新しい方法」を選択し、次に「インストゥルメントメソッド」を選択します。
4. 表1に従って平衡カラム法をプログラムします。流速を1.00 ml/minに設定し、UV検出器を260 nmで読み取るようにプログラムします。装置メソッドを保存し、「ファイル」メニューから「新規メソッド」を再度選択し、「メソッドセット」を選択します。以前に保存したインストゥルメントメソッドを選択し、現在のメソッドセットを同じ名前で保存します。
5. 手順2.3を繰り返して、表2に示すサンプルメソッドをプログラムします。流速を 1.00 mL/min に設定し、UV 検出器を 260 nm で読み取るようにプログラムします。装置メソッドを保存し、ステップ4.4で説明したのと同じ手順を繰り返してメソッドセットを保存します。
6. 「サンプルの実行」ボタンを選択し、「ファイル」メニューから「新しいサンプルセット方法」を選択します。
7. 「empty」オプションを選択し、バイアルの番号(オートサンプラー内)、サンプル名、注入量(50 μl)を入力します。「method set」列には以前に保存したメソッドセットを選択し、合計実行時間(分)を入力します。
   注:各サンプル分析の前に「分析法セット」列に平衡カラム法(表 1)を入力し、合計分析時間(分)を入力します。

3. 各化合物の標準検量線の生成

1. 表1および表2に記載されている方法に従って、ブランク(アデノシンデアミナーゼを含まない特定の無血清培地)および各標準サンプル50μlを注入します。
   1. 各サンプル分析の前に平衡カラム法(表 1)を使用し、表 2 に記載されているグラジエント条件を設定して、適切なピーク分離を得てください。これらのHPLC条件下でのAMP、ADO、およびINOの報告された保持時間については、表3を参照してください。
   2. HPLCソフトウェアの「process」ボタンを選択し、次に「integrate」オプションを選択して、異なる濃度でのAMP、ADO、およびINOのピーク面積を決定します。または、各ピークの始点と終点を手動で選択します。
   3. 各標準試料の公称濃度に対するピーク面積をプロットして、9 ポイントの検量線(100、50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25 μM)を求めます。
   4. AMP、ADO、INO の直線の方程式を計算します: y = mx + b,
      ここで、xはμM濃度、yはピーク面積に対応します。
   名 名 名 名

   時間	流量(ml / min)	%A	%B
   	1.00	100	0
   1.24	1.00	100	0
   6.22	1.00	2	98
   18円65銭	1.00	2	98

   >表 1: 平衡化カラム法。カラムの平衡化のための溶媒変化の概略図。緩衝液A:7 mM酢酸アンモニウム、pH 3.0。バッファーB:アセトニトリル。

   名 名 名 名 名 名

   時間	流量(ml / min)	%A	%B
   	1.00	0	100
   3.74	1.00	0	100
   13.71	1.00	15	85
   17:00	1.00	100	0
   20円00分	1.00	100	0

   表2:サンプルメソッドを実行します。プリン化合物のHPLC測定における溶媒変化の概略図。緩衝液A:7 mM酢酸アンモニウム、pH 3.0。バッファーB:アセトニトリル。

   名 名 ) 名

   	リテンション期間	λMAX
   アンプ	8.00 分	260
   井野	11.00 分	260
   骨折り	11.90 min(英語	260

   >表3:プリン化合物の保持時間。AMP、ADO、およびINOで観察された典型的な保持時間。UV検出器は、260nmで読み取るようにプログラムされています。

   4. 阻害剤による前処理と基質(AMP)によるインキュベーション

   1. CD73、ADA、ヌクレオシドトランスポーターを阻害しないADOおよびINOの産生、AMPの消費をテストするには、精製した2 x 10⁶ CD19⁺/CD5⁺ CLL細胞を250 μlの無血清培地およびプレート細胞の48ウェルプレート(または1.5 mL微量遠心チューブ)に再懸濁します。
   2. 250 μl の 400 μM AMP または AMP plus 阻害剤を添加して、最終濃度 200 μM AMP を得ます。ブランクサンプルとして使用する基質が存在しない状態での条件を含めます。
   3. 37°Cで30〜60分間インキュベートします。
   4. インキュベーション時間の終了時に、上清500 μlを冷たい微量遠心チューブ (氷上) に集め、直ちに17,000 x g、4°C、5分間遠心分離します。
   5. 上清を新しい1.5 mL微量遠心チューブに移し、すぐに-80°Cで保存するか、HPLCランのサンプル調製に進みます。

   5. HPLCのサンプル調製

   1. 新しい1.5 mL微量遠心チューブで上清を0.2 μmシリンジフィルターでろ過します。ろ過には1mlの注射器を使用してください。
   2. HPLCシステムにオートサンプラーが付属している場合は、HPLC用のガラスバイアルを調製し、少量のサンプルには0.1 mLのマイクロインサートを使用します。
   3. ガラスバイアルに少なくとも100 μlのサンプルをマイクロピペットまたはガラスパスツールピペットで移します。気泡が出ないように注意し、バイアルをスクリューキャップで閉じてください。
   4. これで、サンプルをRP-HPLCで分析する準備が整いました。

   6. HPLCによるプリン体の測定

   1. 「サンプルの実行」ボタンを選択し、「ファイル」メニューから「新しいサンプルセット方法」を選択します。
   2. 「empty」オプションを選択し、バイアルの番号(オートサンプラー内)、サンプル名、注入量(50 μl)を示します。
   3. 表 1 と表 2 で説明されている平衡カラム法と分析サンプル分析法を、その後に続くすべてのブランク分析とサンプル分析でそれぞれ選択します。
      手記：各サンプル分析の前に、平衡化カラム法(表1)を設定してください。
   4. ブランク (無血清培地) 50 μlと各サンプルを注入します。
   5. 各サンプル中のプリン体の濃度を決定し、表 3 に示す保持時間でのピーク面積を取得して、AMP、ADO、および INO を定量します。
      1. 「プロセス」ボタンを選択し、次に「統合」オプションを選択します。または、各ピークの開始点と終了点を手動で選択して、面積測定値を取得します。これは、ピークの開始点と終了点の間の線をトレースすることによって行われます。
      2. 標準曲線について得られた式(y = mx + b、ここで x は μM 濃度、y は未知サンプルから測定したピークの面積)を適用して μM 濃度を求めます。.
         注:ADOキャリブレーション標準曲線の例を図1に示します。ここで、x =(y面積 - 981.02)/40026
   6. 2 x 10⁶ 細胞を 0.500 ml の培地に再懸濁したことを考慮し、10^{個の 6} CLL 細胞が消費および/または産生した AMP、ADO、および INO の μmol を次の比率で計算します
      μモル:1,000ml=×μモル:0.250ml
      手記：1,000 ml中のμmol(1 L中のμmol数)はμM濃度に相当し、xは10⁶細胞によって産生されるヌクレオチドまたはヌクレオシドのμmolである。最後に、μmolesを10個の⁶ CLL細胞で消費および/または産生されたnmoleに変換します:nmoles = μmoles x 1,000

結果

図 1.内部標準曲線の生成。ADOの代表的な校正標準曲線と得られた相対式 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AIM V無血清培地	ギブコ	12055-091	液体(研究用グレード)
アデノシン5'-モノスフェート(AMP)	シグマ・アルドリッチ	A1752(英語版)
アデノシン(ADO)	シグマ・アルドリッチ	A9251の
イノシン(INO)	シグマ・アルドリッチ	I4125
アセトニトリル(クロマソルブプラス)	シグマ・アルドリッチ	34998	HPLCグレード
酢酸アンモニウム	シグマ・アルドリッチ	9688名	7 mM、pH 3.0
ショートスレッドバイアル	VWRの	〒548-0029	1.5 ml /ガラス
マイクロインサート	VWRの	〒548-0006	0.1 ml /ガラス
スクリューキャップ	VWRの	〒548-0085	9 mm / PPブルー
Atlantis dC18 コラム	水	186001344	5 μm、4.6 mm x 150 mm
Atlantis dC18 ガードコラム	水	186001323	5 μm、4.6 mm x 20 mm
Waters Alliance 2965 セパレーションモジュール	水		HPLC分離モジュール
Waters 2998 フォトダイオードアレイ (PDA) 検出器	水		UV検出器
Waters Empower2 ソフトウェア	水

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