蛍光標識T-ALL細胞の単離:成体ゼブラフィッシュからT-ALL細胞を単離する方法

要約

出典:Pruitt, M. M., et al. ゼブラフィッシュのMyc誘導T細胞急性リンパ芽球性白血病におけるサイド集団の分離. J. Vis. Exp. (2017).

このプロトコルは、成体のゼブラフィッシュから蛍光標識T細胞急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)腫瘍細胞を単離し、トリパンブルー色素を使用してそれらを定量化する技術について説明しています。

プロトコル

>1. 原発腫瘍魚からの蛍光標識T-ALL細胞の採取

1. 0.9倍リン酸緩衝生理食塩水(FBS / PBS)に少なくとも20 mLの10%熱不活化ウシ胎児血清を調製します。.
2. 1 mLのFBS/PBSをヘパリンナトリウム塩1バイアル(300単位)に加えます。
3. 体の50%以上に腫瘍を持つ魚、または食事や水泳が困難な魚を選択します。魚にトリカインを過剰摂取するか、氷水に浸すことで魚を犠牲にします。鰓の動きと心拍の欠如により死亡を確認します。
4. かみそりの刃を使用して、魚の頭を取り除きます。
5. 魚の空洞をヘパリン溶液で洗い、余分な赤血球を取り除きます。
   1. ピペットを使用して、100μLのヘパリン溶液を注入します(ヘパリンナトリウム塩の1つのバイアルに1mLのFBS/PBSを追加します)魚の体腔に。こぼれた液体(血球が含まれています)をすべて取り除き、1.5mLの微量遠心チューブにピペットで入れます。
   2. 新しいピペットチップを使用して、体を再度洗います。少なくとも3回の洗浄を行うか、こぼれた液体に血液がなくなるまで行ってください。
   3. これらのステップで洗浄した液体は、今後の分析に使用されないため、すべて廃棄してください。
6. 白血病細胞を採取します。
   1. 100μLのFBS / PBSを魚の体腔に注入します。
   2. ピペットの先端で魚の体の外側にやさしく圧力をかけ、腫瘍細胞を圧迫/押し出します
      手記：このステップを解剖顕微鏡を使用して実行すると、体腔からこぼれた腫瘍細胞が明らかになります。
   3. 各洗浄液から液体と細胞を1.5 mLの微量遠心チューブに集めます。
   4. ほとんどの腫瘍細胞が収集されるまで(通常は5〜10回)、手順1.6.1〜1.6.3を繰り返します。すべての腫瘍細胞を同じ1.5 mL微量遠心チューブに集めます。細胞を室温に保ちます。
7. 前のステップで採取した腫瘍細胞をピペッティングして混合し、細胞の塊を解離させます。細胞懸濁液を40μmメッシュフィルターでろ過します。フィルターを100μLのFBS/PBSで1〜2回洗浄します。細胞を室温に保ちます。
8. 2 μL の細胞懸濁液を 18 μL のトリパンブルー (0.4%、1:10 に希釈してろ過) と新しいチューブで混合します。血球計算盤に10μLをロードし、生(非青色)蛍光細胞の数を数えて、単離された腫瘍細胞の数を計算します。
   手記：青色以外のGFP陰性細胞は、正常で非悪性のT細胞である可能性が高く、カウントすべきではありません。Hoechst 33342で細胞を染色するには、少なくとも2 x 10⁶細胞が必要です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
同系ゼブラフィッシュ(CG2)			Mizgireuv et al., 2006 を参照
RAG2:C-MYCプラスミド			ランゲナウ研究室
rag2:de Jong Labで構築したGFPプラスミド			rag2プロモーター(Langenau研究室)
pCS2-トランスポゼースプラスミド			齋燕研究室
SteREO Discovery V8 顕微鏡	カールツァイス顕微鏡	495015-0008-000
トリカインメタンスルホン酸(MS-222)	ウエスタンケミカル株式会社	フィッシャーサイエンティフィック - NC0342409	100グラム
ウシ胎児血清(FBS)	(株)ハイクローンラボラトリーズ	フィッシャーサイエンティフィック - SH3007103	500ミリリットル
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	ライフテクノロジーズのギブコ	1001-023	pH 7.4 (1倍) - 500 mL
ヘパリンナトリウム塩	シグマ・アルドリッチ	2106	15 - 300ユニットバイアル
40μmメッシュフィルター	Falcon Corningブランド	352340	50のケース
トリパンブルー	シグマライフサイエンス	T8154	20 mL - 溶液(0.4%)