Side Population Assay:ゼブラフィッシュから腫瘍細胞のサイドポピュレーションを単離する方法

要約

出典:Pruitt, M. M., et al. ゼブラフィッシュのMyc誘導T細胞急性リンパ芽球性白血病におけるサイド集団の分離. J. Vis. Exp. (2017).

次のプロトコルは、成体のゼブラフィッシュから幹細胞からなるT細胞急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)腫瘍細胞の側集団を単離する方法を説明しています。サイドポピュレーションには顕著な細胞マーカーがないため、Hoechst 33342色素排出アッセイを使用してそれらを単離します。

プロトコル

1. 蛍光標識T-ALL細胞をHoechst 33342で染色し、サイドポピュレーションを同定

1. Hoechst 33342 1:10をヌクレアーゼフリーのH₂Oで希釈し、1 mg/mLの作業濃度にします。染料は4°Cで暗所に保管してください。
2. 49.1 mgをジメチルスルホキシド(DMSO)1 mLに溶解して、ベラパミルの100 mM溶液を調製します
   手記：ベラパミルはABCトランスポーターの阻害剤であり、サイドポピュレーション実験の重要なコントロールです。サンプルにベラパミルを添加すると、ABCトランスポーターがHoechst 33342色素を排出する能力が阻害されます。したがって、ベラパミルをサンプルに加えると、真の側集団は消えます。
3. ウォーターバスを28°Cに設定します。
4. 暗所でサンプルとコントロールを調製するには、蛍光活性化セルソーター(FACS)チューブに細胞と溶液を添加します。
   1. サンプルを調製するには、⁶細胞10個、1 mg/mL Hoechst 33342 15 μL、およびDMSO2.5 μLをFACSチューブに加えます。FBS/PBSで容量を1mLに調整します。
   2. 10個の⁶細胞、15 μLの1 mg/mL Hoechst 33342、および2.5 μLの100 mM ベラパミルをFACSチューブに加えて、コントロールを調製します。FBS/PBS.
      で容量を1mLに調整します 手記：最低10⁶細胞/サンプルが推奨されますが、特にサイドポピュレーション細胞をさらに分析するために選別する場合は、より多くの細胞を染色することが望ましいです。10⁶細胞/mLを超えないようにし、Hoechst 33342の濃度を15 μg/mLに維持してください。10 x 10⁶細胞を染色した場合、総反応量は10 mLです。
5. 28°Cの水浴中で、暗所で120分間インキュベートします。
6. インキュベーション後、細胞をすぐに氷の上に置き、暗闇に保管します。
7. 細胞を4°Cで6分間、300 x gでペレット状にし、上清を除去します。1mLのFBS / PBSで洗浄します。.
8. 細胞を4°Cで6分間、300 x gでペレット状にし、上清を除去します。細胞を1mLのFBS/PBSに再懸濁します。
9. 細胞が選別されるまで4°Cに保ちます。
10. 細胞ソーティングの15分前に、2 μLのヨウ化プロピジウム(PI)ストック(1 mg/mL)をFBS/PBSの各1 mL(最終濃度:2 μg/mL)に加えます。よく混ぜます。

2. FACSを使用して、蛍光標識されたT-ALL細胞集団内のサイド集団を見つけます

1. Hoechst 33342色素励起用のUVレーザーとPI励起用の488nmレーザーおよびGFP+ T-ALL細胞の検出用のUVレーザーを装備したセルソーターで、染色されたゼブラフィッシュT-ALL細胞懸濁液を分析します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウシ胎児血清(FBS)	(株)ハイクローンラボラトリーズ	フィッシャーサイエンティフィック - SH3007103	500ミリリットル
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	ライフテクノロジーズのギブコ	1001-023	pH 7.4 (1倍) - 500 mL
ヘキスト33342	ライフテクノロジー	H3570-J	10ミリリットル
ベラパミル	シグマライフサイエンス	V4629	1グラム
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマライフサイエンス	D8418	100ミリリットル
ヨウ化プロピジウム	ライフテクノロジー	P3566	10ミリリットル
FACSAria Fusionセルソーター	BDバイオサイエンス