このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

DNA損傷病巣の評価:免疫蛍光染色を用いたがん細胞株における放射線誘発性DNA損傷病巣の同定

1.6K 回視聴

⸱

2023年4月30日

この記事について

要約

出典: Maliszewska-Olejniczak et al. Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells. J. Vis. Exp. (2020年)。

このビデオでは、免疫蛍光染色を使用して結腸癌細胞株の放射線誘発性DNA修復病巣を検出するプロトコルについて説明しています。DNA修復タンパク質は、DNA損傷部位で活性化されます。そのため、特異的な抗体を用いて検出し、蛍光顕微鏡で可視化することができます。

プロトコル

1. 細胞培養の準備と実験のセットアップ

  1. 10 mLの配合されたMcCoy's 5a Medium Modifiedを含む75 cm2培養フラスコの単層に、供給業者が推奨するようにヒト結腸癌細胞HCT-116を維持し、10%のウシ胎児血清と1%の抗生物質抗真菌溶液を補給します。
  2. 加湿した5%CO2環境、37°Cで70%のコンフルエントになるまで細胞を増殖させ、2〜3日ごとに培地を更新してください。
  3. BNCTビーム(中性子線とBPAの併用など)と、がん細胞を重粒子として死滅させ、そのエネルギーの大部分をホウ素含有がん細胞内に沈着させるBNCT効果を得るためには、照射前日に、細胞培養培地にホウ素送達剤(10BPA、4-ボロノ-L-フェニルアラニン(10 μg 10B/mL、 0.925 mM final) 照射の12-16時間前(ホウ素の最大取り込み)
    手記：BNCT研究の場合にデータが存在しない別の細胞株を使用する場合は、各細胞株のホウ素取り込みをテストして、最適なホウ素濃度を取得します。Dagrosaグループが実施した誘導結合プラズマ発光分光法(ICP-OES)により、BPA細胞の取り込みを測定します。
  4. ホウ素の送達後、培地を吸引し、1x PBSの10 mLで細胞を洗浄します。次に、2 mLのトリプシン-EDTA溶液を細胞に添加して細胞をトリプシン化し、37°Cで5分間インキュベートして細胞の剥離を促進します。細胞が剥離し始めたら、10 mLの完全培地を追加してトリプシンの作用を停止します。
  5. 15 mLチューブで細胞懸濁液を吸引し、自動セルカウンターを使用して、10 μLの0.4%トリパンブルーを10 μLの細胞に加え、混合し、計数スライドで10 μLを分注します。細胞懸濁液を培地の1 x 106細胞/mLの濃度に希釈します。クライオチューブあたり1 mLの細胞懸濁液を分注します。
  6. ガンマ線線量の測定用の熱ルミネッセンス線量計(TLD)と中性子フルエンシー用の金箔を準備し、照射前にクライオチューブまたは細胞培養フラスコにTLDを取り付けます。
  7. 施設の能力に応じて、1 x 106 cells/mLに、推奨される最小熱中性子束5.9 x 1011 (n/cm-2 min-1)4で中性子混合ビームを培養フラスコまたはクライオチューブに照射します
    手記：推奨される中性子束を得るために、照射時間を事前に設定してください。
  8. 照射後、照射した細胞1 mL(1 x 106細胞/mL)を35 mmシャーレまたは6ウェルプレートの22 x 22 mmカバースリップに播種し、必要な培地2 mLを補充します。加湿した5%CO2環境で細胞を37°Cで最大3時間インキュベートし、カバースリップに付着させます。20倍の対物レンズを備えた倒立顕微鏡下で細胞の付着を時々観察します.
    手記：HCT-116細胞の場合、播種する最小密度は600,000細胞です。迅速な染色手順のために、チャンバースライドを使用し、それに応じて細胞密度を下げます。

>2. 細胞の固定

  1. 細胞に照射およびインキュベートした後、付着した細胞から培地を取り出し、2.5mLのPBSで細胞を一度洗浄します。
  2. 70%エタノール1 mLで細胞をRT.
    で10分間固定します 手記：あるいは、以前に推奨されているように、固定には1%〜3.7%のパラホルムアルデヒド(PFA)を使用します。ここでは、プロトコルは一時停止されます。固定細胞をエタノール中の冷凍庫に-20°Cで数週間以内保存し、さらなる分析と免疫蛍光染色を行います。

>3. 細胞の透過化

  1. 固定後、ペトリ皿からエタノールを取り出し、2.5mLの1x PBS.
    で洗浄します。 手記：すすぎステップの間に細胞を乾燥させないでください。
  2. 0.2%のTriton X-100/PBSを1 mL静かに加えて、シャーレの細胞でカバーガラスを覆います。
  3. RTで5分間インキュベートします。
  4. 細胞を2.5mLの1x PBS.
    で3回洗浄します。 手記：必要に応じて、PBS中のTriton X-100の割合を最大0.5%まで増やします(検出可能な病巣が増え、試験した細胞株によって異なります)。PBST(0.5%トゥイーンを含むPBS)で追加の洗浄を行い、不特異的な結合を回避します。
  5. PBSで希釈した2% BSA(ウシ血清フラクションVアルブミン)1 mLで透過処理ステップをブロックし、1% BSA.
    で最低30分または1時間インキュベートします。 手記：このステップは省略でき、使用する抗体の種類によって異なります。または、推奨されているように5%FBSを使用します。

4. 免疫蛍光染色

  1. 推奨量に応じて、PBSでBSA(2% Bovine Serum Fraction V Albumin)で希釈した一次抗体(Anti-ɣ-H2AX、Anti-DNA-PKcs、およびAnti-Rad52)を適量添加します(推奨希釈率については表1を参照)(サンプルあたり100 μLが必要
    2. )。
一次抗体機能推奨希釈ストレージ [°C]
アンチ-h2axDNA-DSBの検出1:1000(PBS-BSAの)4
抗DNA-PKcsNHEJに属するDNA-PKcsタンパク質のRIFの検出1:200(PBS-BSAの)△20
アンチラッド52HRRに属するRad52タンパク質のRIFの検出1:200(PBS-BSAの)△20
二次抗体分からない
マウスIgG FITCɣ-H2AXの焦点1:400(PBS-BSAの)4
ヤギ抗ウサギIgG H&L(Alexa Fluor 488)NHEJおよびHRR修復タンパク質病巣1:500(PBS-BSAの)△20

表1:セクションで使用した抗体の使用に関する推奨希釈液と注意事項

  1. 蒸留水を使用して保湿リグニンを入れたプラスチックの箱にシャーレを覆い、インキュベーターで37°Cで30分間インキュベートします。
    手記：ここでプロトコルを一時停止できます。インキュベーションは4°Cで一晩行うことができます。
  2. インキュベーション後、2.5 mLのPBS.
    で3回の洗浄を行います 手記：すすぎステップ中にスライドを乾燥させないでください。
  3. 適量の二次抗体(anti-mouse IgG FITC、PBSでBSAで希釈したGoat Anti-Rabbit IgG(Alexa Fluor 488)(表1参照)を加えます(サンプルあたり100 μLが必要です)。この手順と次の手順では、暗闇の中で作業します。
  4. プラスチックの箱に湿潤リグニンを入れたプラスチックの箱にペトリ皿を再度蓋をして湿度を維持し、インキュベーター内で37°Cで最低30分間インキュベートします。
  5. インキュベーション後、PBS2.5mLで3回の洗浄を行います。
  6. PBSで希釈したDAPI100 μLを最終濃度1 μg/mLまで加えて、核を対比染色します。
  7. RTで2分間、まもなくインキュベートします。
  8. インキュベーション後、PBS2.5mLで3回の洗浄を行います。
  9. PBSを取り外し、気泡の形成を避けて封入剤の上部にカバースリップを静かに置き、カバースリップの端をマニキュアでシールします。ニスが乾くまで待ってから、カバーガラスを塗ります。
  10. 封入剤の硬化(最大3時間)を待ってから、蛍光顕微鏡で画像解析してください.
    手記：ここでプロトコルを一時停止できます。スライドガラスは、暗闇の中で4°Cのプラスチックボックスに保管してください。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
12mmカバースリップVWRの89015-725
35mmシャーレザルシュテット7.183.390.000
4-ボロノ-L-フェニルアラニンシグマ・アルドリッチ17755
抗生物質-抗真菌薬(100倍)ギブコ15240062
抗DNA PKcs(リン酸化S2056)抗体 - ChIPグレードアブカムAB18192
抗マウスIgG(全分子)–ヤギで産生されたFITC抗体シグマ・アルドリッチF0257
抗リン酸化ヒストンH2A。X (Ser139) 抗体、クローン JBW301メルクミリポア05-636
抗RAD52抗体アブカムAB117097
ウシ血清アルブミンフラクションV(BSA)ロシュBSAV-RO
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)サーモフィッシャー サイエンティフィックD1306
ウシ胎児血清(熱不活化)シグマ・アルドリッチF9665
ヤギ抗ウサギIgG H&L(Alexa Fluor 488)アブカムAB150077
HCT-116細胞株ATCCのCCL-247™
イメージJ国立衛生研究所(NIH)https://imagej.nih.gov/ij/
イメージプロメディアサイバネティックスhttps://www.mediacy.com/imagepro
顕微鏡スライドサーモフィッシャー サイエンティフィックB-1198
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS (英語)20.59.52.0
トリトンX-100シグマ・アルドリッチX100
トリパンブルーステイン、0.4%ロゴスバイオシステムズT13001
トリプシン-EDTA溶液0.25%シグマ・アルドリッチT4049
の の

さらに記事を探す

$\gamma$-H2AXリン酸化蛍光顕微鏡観察一次抗体染色二次抗体検出DAPI核対比染色細胞透過化PBS洗浄プロトコル
DNA損傷病巣の評価:免疫蛍光染色を用いたがん細胞株における放射線誘発性DNA損傷病巣の同定
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。