DCFH-DA染色によるROS検出:結腸直腸癌細胞株の総ROSの測定

要約

出典:Kim, H., et al. 2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート染色による接着細胞内の全活性酸素種の検出。J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオでは、2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)を使用して全細胞活性酸素種(ROS)を検出するためのプロトコルについて説明しています。この方法は、蛍光顕微鏡を使用して接着細胞内のROS局在を視覚化し、蛍光プレートリーダーでROS強度をさらに定量化するのに役立ちます。

プロトコル

1. セルシーディング

1. 24ウェルプレートでウェルあたり2 x 10⁵ HCT116結腸直腸癌細胞を播種し、細胞をダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)で一晩37°Cに維持します。
2. 100 μMの硫酸第一鉄(FS)または10 μMのドキソルビシン(DOX)含有培地を含む培地を含む培養液を添加または使用せず、培地を24時間インキュベー
トします。

2. DCFH-DA溶液の準備

1. 4.85 mgのDCFH-DAを1 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して、10 mMのストック溶液を作ります。
2. ウェルに加える直前に、あらかじめ加温したDMEMでストック溶液を10 μMの作業溶液に希釈します。
3. 作業溶液を10秒間ボルテックスします。

>3. DCFH-DA染色

1. 薬剤含有培地を取り出し、DMEMで一度洗浄します。
2. 500 μLのDCFH-DAワーキング溶液を各ウェルに加え、37°Cで30分間インキュベートします。
3. DCFH-DAの作業溶液を取り外します。DMEMで1回洗浄し、1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄します。
4. 各ウェルに500 μLの1x PBSを添加します。

4. 画像取得と強度測定

1. 蛍光顕微鏡上の緑色蛍光タンパク質(GFP)チャンネルを使用して、各ウェルの代表的な蛍光画像を撮影します。
2. 画像を撮影した後、PBSを取り出し、200 μLの放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファーを各ウェルに加えます。
3. 氷上で5分間インキュベートした後、細胞ライセートを1.5 mLのチューブに集めます。
4. 21,130 x gで4°Cで10分間遠心分離します。
5. 上清100μLを黒色の96ウェルプレートに移し、蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、励起波長485 nm、発光波長530 nmで蛍光強度を測定します。
6. 1 μLの上清を100 μLの1xタンパク質アッセイ溶液が入った透明な96ウェルプレートに移し、Bradfordアッセイを使用してタンパク質濃度を測定します。
7. 蛍光強度をタンパク質濃度で正規化します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテート	ケイマンケミカル、ミシガン州アナーバー	20656
塩酸ドキソルビシン	TCIアメリカ、ポートランド、オレゴン州	D4193-25MG
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム	コーニング、コーニング、ニューヨーク	45000から304
Invitrogen EVOS FL オートイメージングシステム	サーモフィッシャーサイエンティフィック マサチューセッツ州ウォルサム	AMAFD1000	またはその他の蛍光顕微鏡
タンパク質アッセイBradford溶液	バイオ・ラッド、カリフォルニア州ヘラクレス	5000001
SpectraMax M2 マイクロプレートリーダー	Molecular Devices, Radnor, PA (ペンシルベニア州ラドナー	89429-532	またはその他の蛍光マイクロプレートリーダー
硫酸第一鉄七水和物	VWR、ラドナー、ペンシルバニア	97061-542

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