大腸癌のPDOXマウスモデルの生成:マウスモデルにおける大腸癌の進行の研究

要約

出典:Moret, R. et al. ヒト尿路上皮細胞癌および結腸直腸癌腫瘍の成長と自然転移に対する患者由来の同所性異種移植モデル。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、非肥満の糖尿病/重症複合免疫不全症(NOD/SCID)マウスにおける結腸直腸癌細胞の進行を研究するために、患者由来の同所異種移植片結腸直腸癌マウスモデルを生成するためのプロトコルについて説明しています。このマウスモデルは、原発腫瘍の成長と転移パターンを理解するのに役立ちます。

プロトコル

動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 細胞株の培養

1. 5% CO₂加湿インキュベーターで、10% ウシ胎児血清、2 nM グルタミン、100 U/mL ペニシリン G、および 100 mg/mL ストレプトマイシンを 37 °C で添加した完全 RPMI-1640 培地で HK 細胞を増殖させます
   手記：HK細胞は正常なヒト濾胞樹状細胞であり、in vitroで≤15継代にわたって増殖および増殖できます。

2. ルシフェラーゼ標識腫瘍のタグ付けと濃縮

1. 生後6〜8週齢の雌のNOD / SCIDマウスの左右の脇腹に直接腫瘍を移植します。
2. デジタルキャリパーを使用して隔週で腫瘍の成長を測定します。
3. 直径1cmで腫瘍を形質導入します。27 G 針付きの 1 cc シリンジを使用して、Luc/赤色蛍光タンパク質 (RFP) レンチウイルス (50 μL/腫瘍、濃縮高力価レンチウイルスストックから 1:30 希釈) の単回投与を腫瘍に直接注入します。
   手記：患者の腫瘍は通常、1〜2か月で直径1cmに達します。ただし、成長率は非常に変動し、腫瘍の悪性度や種類など、多くの要因に基づいています。

3. CRCマウスモデル

1. 6〜8週齢の雄のNOD / SCIDマウスをイソフルラン(100%酸素中2.5%、1L / min)で麻酔します。つま先をつまんで鎮静を確認します。
2. 麻酔をかけたマウスを解剖顕微鏡下で仰臥位にし、鼻をイソフルラン鼻円錐に固定し、前肢をテープで固定して安定性を確保します。
   手記： ルーペは、解剖顕微鏡の代わりに使用できます。小さな物体を尾の付け根の下に置くと、視認性と角度が向上し、肛門が浮き上がります。通常、ガーゼの小さな部分は直径1インチの円柱状に丸められます。
3. 湾曲した潤滑性の鈍い先端の鉗子で肛門管を拡張し、遠位の肛門と直腸粘膜を露出させます。糞便を取り除きます。
4. 50 μL ガラス製シリンジに滅菌済みの 30 G の取り外し可能な針を使用して、10 μL のルシフェラーゼタグ付き腫瘍細胞と HK 細胞 (完全な RPMI 培地の CRC モデルのマウスあたり 10 μL の腫瘍細胞を再懸濁します) を、肛門管の 1 〜 2 mm 上の遠位後直腸粘膜下組織に注入します。針の斜角は粘膜で覆われている必要があります。骨盤腔内に入らないように注意してください。
5. マウスをイソフルランノーズコーンから取り外します。手順後1時間観察してください。苦痛の兆候、つまり猫背、苦しい呼吸などを探します。

4. 生物発光イメージング

1. ルシフェラーゼ活性について、生物発光イメージングシステムを使用して、原発腫瘍、肝臓、および肺の転移性負荷を毎週監視します。
   1. マウスのCRC実験を行い、体重を量ります。150 mg / kgルシフェリンを腹腔内に注射し、基質がマウスの体内を循環するまで5分間待ちます。.
   2. 100%酸素中の2.5%イソフルラン、誘導チャンバー内で1 L / minでマウスを麻酔します。
   3. マウスをBLIイメージングマシンに置き、ノーズコーンにノーズを固定します。画像に露出するときは、関心領域がカメラに面していることを確認してください。CRC注入の場合、各画像について腹側がカメラに面している必要があります。仰臥位のマウスをイメージしてください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMI-1640 ミディア	アメリカンタイプカルチャーコレクション	110636
イソフルラン	ヘンリー・シャイン動物衛生	108333
D-ルシフェリン(150mg / kg)	パーキン・エルマー	122796
グルタミン (2 nM)	フィッシャーサイエンティフィック	35050061
Luc/RFP-レンチウイルス	私たちの協力者から。参考文献13参照:Gills, J. et al.膀胱腫瘍の移植、成長、血管新生、および転移のヒト高悪性度尿路上皮細胞癌を可能にする患者由来の同所異異移植モデル。オンコターゲット。9, 32718-32729, doi:10.18632/ oncotarget.26024 (2018).
ペニシリン/ストレプトマイシン 100 mL (100 U/mL)	フィッシャーサイエンティフィック	15140-122
気体
酸素100%	エアガス株式会社	オックス USP200
100%のCO2	エアガス株式会社	CD USPEの
マウス
6-8週齢のNOD/SCIDマウス(メス)	ジャクソン研究室	1303
ツール
15 mLコニカルチューブ	ザルシュテット	11799
150 mmティッシュカルチャーディッシュ	USAサイエンティフィック社	CC7682-3614
鉗子	シンメトリーサージカル株式会社	06-0011
手術用ハサミ	シンメトリーサージカル株式会社	2011年02月〜
備品
5% CO2加湿インキュベーター	サーモサイエンティフィック	3110
生物発光(BLI)イメージングマシン	パーキン・エルマー	CLS136334
BLIイメージングマシンソフトウェア	パーキン・エルマー	CLS136335
デジタルノギス	ファウラーツールと機器	54-115-330
解剖顕微鏡	精密機器LLC	(504)228-0076
イソフルラン誘導チャンバー	パーキン・エルマー	119038