方法論記事

プレターゲット放射性免疫療法:治療用放射性核種を腫瘍に標的送達する方法

2023年4月30日

この記事について

要約

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出典: Membreno, R., et al. 逆電子要求量ディールス・アルダー反応に基づくプレターゲット放射線免疫療法 J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、腫瘍の治療のために免疫複合体とそれに続く放射性リガンドを投与するプレターゲット放射性免疫療法またはPRITの技術について説明しています。この放射線免疫療法は、健康な組織への放射線量を減らし、抗体ベースのベクターと互換性のない非常に短い半減期の放射性核種を利用します。

プロトコル

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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. huA33-TCOの準備

>注:huA33-TCOの合成は以前に報告されています。ただし、読みやすくするために、ここでは最適な条件に調整して複製しています。

  1. 1.7 mLの微量遠心チューブに、(E)-シクロオクト-4-エニル 2,5-ジオキソ-1-ピロリジニルカーボネート(TCO-NHS)を乾燥ジメチルホルムアミド(DMF)に40 mg/mL(0.15 M)の濃度で125 μL溶液を調製します。この溶液は、将来の実験で使用するために、-80°Cで分注および凍結することができます。
  2. 別の1.7 mL微量遠心チューブで、1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS;2.7 mM塩化カリウム、137 mM塩化ナトリウム、および11.9 mMリン酸カリウム、pH 7.4)に5 mg/mLのhuA33溶液を調製します。
  3. 0.1 M Na2CO3の小さなアリコート(<5 μL)を使用して、抗体溶液のpHをステップ1.2から8.8-9.0に調整します。pHペーパーまたは微小電極付きのpHメーターを使用してpHを監視し、pHが9.0を超えないように注意してください。
  4. ステップ1.3で説明した抗体溶液に、抗体の量に対してTCO-NHSの40モル当量に相当する容量をゆっくりと加えます。例えば、溶液中に5 mg(30 nmol)のhuA33が含まれている場合は、TCO-NHS.
    の40 mg/mL(0.15 M)溶液を9.0 μL(1.20 μmol)加えます 手記：TCO-NHSは疎水性です。抗体溶液に添加する際は、沈殿を防ぐためにゆっくりと攪拌しながら添加してください。最終反応溶液中のDMFを体積で10%を超えないようにしてください。
  5. 反応を25°Cのサーモミキサーで1時間インキュベートし、軽度の攪拌(500rpm)を行います。
  6. 1時間後、あらかじめ充填された使い捨てサイズ排除脱塩カラムを使用して、huA33-TCO免疫複合体を精製します。
    1. サプライヤーの説明に従ってサイズ除外カラムを平衡化し、保管中にカラムに存在する防腐剤をすべて除去します。一般的な手順では、カラムの容量に対応する容量のPBS(5 x 2.5 mLのPBS)でカラムを5回洗浄します。
    2. 反応混合物をサイズ排除列に追加し、反応混合物の体積を示します。
    3. 反応混合物がカラムに入ったら、適切な量のPBSを添加して、カラムに添加する溶液の総量を最大2.5 mLにします。例えば、標識反応の総容量が 1.3 mL になった場合は、カラムに 1.2 mL の PBS を追加で追加します。
    4. 溶離液として2mLのPBSを使用して製品を回収します.
      手記：このステップにより、2 mL の PBS、pH 7.4 で最終コンストラクト huA33-TCO が得られます。
  7. 280 nmの波長を監視するUV-Vis分光光度計を使用して、huA33-TCOの濃度を測定します。ほとんどのIgG(ε 280)のモル吸光係数は210,000 M-1 cm-1です。
  8. より高濃度の免疫複合体を含む溶液が必要な場合は、製造元の指示に従って、分子量50,000のカットオフを持つ遠心フィルターユニットを使用してhuA33-TCO溶液を濃縮します
    手記：多くの抗体は、濃縮中に凝集または沈殿することが知られています。新しい抗体でこの手順を試みる場合、研究者は文献や問題の抗体を扱った自身の経験に従う必要があります。
  9. 完成したhuA33-TCO免疫複合体は、すぐに必要な場合は、暗所で4°Cで保管してください。今後4日以上使用する場合は、暗所で-80°Cで保存してください
    手記：これは、プロシージャーの許容可能な停止ポイントです。完成したhuA33-TCO免疫複合体は、暗所で-80°Cで少なくとも6ヶ月間保存すると安定しているはずです。

2. Tz-PEG 7-NHBocの合成

  1. 1.7 mLの微量遠心チューブに、5 mgのテトラジンN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(Tz-NHS;12.6 μmol)を0.15 mLの無水ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解します。
  2. 別の1.7 mLマイクロ遠心チューブで、Bocで保護されたアミノPEGポリマーO-(2-アミノエチル)-O'-[2-(Boc-アミノ)エチル]ヘキサエチレングリコール(NHBoc-PEG7-NH2;17.1 μmol)を0.15 mLの無水DMSOに溶解します。
  3. Tz-NHSの溶液に、トリエチルアミン(TEA)3μL(21.3μmol、1.7モル当量)を加え、よく混ぜ合わせます。
  4. ステップ2.2のNHBoc-PEG7-NH 2溶液にピンク色のテトラジン溶液を添加し、反応混合物を室温(RT)で30分間インキュベートし、軽度の攪拌を行います。
  5. 30分後、反応混合物をH2Oで1:1に希釈し、逆相C18高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用して精製し、未反応のTz-NHSをTz-PEG 7-NHBocから分離します。酸を含まない溶媒を使用して、Boc保護基の早期除去を防ぎます。Tz-PEG 7-NHBoc と Tz-NHS の両方を波長 525 nm.
    で監視します 手記：保持時間は、各ラボのHPLC機器(ポンプ、カラム、チューブなど)に大きく依存するため、精製前に適切な制御を行う必要があります。しかし、一例を挙げると、5:95 MeCN/H2O(いずれも添加剤なし)から95:5 MeCN/H2Oまでのグラジエントを30分かけて、流速1 mL/min、分析用4.6 mm x 250 mm C18カラムを用いると、Tz-NHSとTz-PEG 7-NHBocの保持時間は約16分と18分となります。 それぞれ。
  6. 回収したHPLC溶離液を液体窒素で凍結し、凍結した回収チューブをアルミホイルで包みます。凍結した収集チューブを凍結乾燥機に一晩置いて、HPLC移動相を除去します。製品は特徴的な明るいピンクの固体になります.
    手記：液体窒素が利用できない場合は、回収したHPLC溶離液をドライアイスで凍結するか、-80°Cの冷凍庫で一晩凍結します。

3. Tz-PEG7-NH 2の合成

  1. ステップ2.6、Tz-PEG 7-NHBocの製品に1.5 mLのジクロロメタン(DCM)を加え、この溶液を小さな丸底フラスコに移します。
  2. ステップ3.1のピンク色の溶液に0.25mLのトリフルオロ酢酸(TFA)を滴下します。
  3. 反応を室温で30分間インキュベートし、軽度の攪拌を行います。
  4. 30分後、ロータリーエバポレーションにより溶媒を蒸発させます。ウォーターバスの温度である37°Cを超えないようにしてください。
  5. ピンク色の粘性製品を0.5mLの水で再構成します。.
  6. 逆相C18 HPLCを使用して製品を精製し、Tz-PEG7-NH 2をBoc保護前駆体から分離します。Tz-PEG 7-NHBoc と Tz-PEG7-NH 2 の両方を波長 525 nm.
    でモニターします。 手記：保持時間は、各ラボのHPLC機器(ポンプ、カラム、チューブなど)に大きく依存するため、精製前に適切な制御を行う必要があります。しかし、一例を挙げると、5:95 MeCN/H2O(いずれも0.1% TFA)から95:5 MeCN/H2Oまでのグラジエントを30分かけて、流速1 mL/min、分析用4.6 mm x 250 mm C18カラムを用いると、Tz-PEG 7-NHBocとTz-PEG 7-NHBocの保持時間は18分と13分程度となります。 それぞれ。
  7. 回収したHPLC溶離液を液体窒素で凍結し、凍結した採取チューブをアルミホイルで包みます。凍結した収集チューブを凍結乾燥機に一晩置いて、HPLC移動相を除去します。製品は明るいピンクのソリッドになります。
  8. ステップ 3.7、Tz-PEG7-NH 2 の製品を 150 μL の DMSO で再構成し、1.7 mL の微量遠心チューブに移します。
  9. 525 nmの波長を監視するUV-Vis分光光度計を使用して、Tz-PEG7-NH 2の濃度を測定します。Tz-PEG7-NH 2 (ε525) のモル吸光係数は 535 M-1 cm-1 です。

>4. Tz-PEG 7-DOTAの合成

  1. Tz-PEG7-NH 2(4.5 mg、6.9 μmol)を0.15 mLのDMSOに溶解します(または、ステップ3.8で作成した溶液を続行します)。
  2. ステップ4.1のテトラジン含有溶液に、22モル当量のTEA(21 μL、0.15 mmol)を加えます。
  3. 10 mg(14.2 μmol)のp-SCN-Bn-DOTAを固体として加え、溶液を約2分間、または材料が完全に溶解するまでボルテックスします。
  4. 反応を室温で30分間インキュベートし、軽度の攪拌を行います。
  5. 30分後、反応液をH2Oで1:1に希釈し、逆相C18 HPLCを用いて生成物を精製し、未反応のp-SCN-Bn-DOTAを除去します。p-SCN-Bn-DOTAは254nmの波長で監視でき、Tz-PEG7-DOTAは525nmの波長で最適に監視できます
    手記：保持時間は、各ラボのHPLC機器(ポンプ、カラム、チューブなど)に大きく依存することは明らかであり、精製前に適切な制御を行う必要があります。しかし、一例を挙げると、5:95 MeCN/H2O(いずれも0.1% TFA)から95:5 MeCN/H2Oまでのグラジエントを30分かけて行い、分析用4.6×250 mm C18カラムを用いると、Tz-PEG7-DOTAとp-SCN-Bn-DOTAの保持時間はそれぞれ約15.6分と16.1分になります。
  6. 回収したHPLC溶離液を液体窒素で凍結し、凍結した回収チューブをアルミホイルで包みます。凍結した収集チューブを凍結乾燥機に一晩置いて、HPLC移動相を除去します。製品は明るいピンクの粉になります。
  7. 0.15 mLのDMSOで製品を再構成し、525 nmの波長を監視するUV-Vis分光光度計を使用して濃度を測定します。Tz-PEG7-DOTA(ε525)のモル吸光係数は535 M-1 cm-1です。
  8. 核磁気共鳴(NMR)と高分解能質量分析(HRMS)により最終化合物を解析し、合成が成功したことを確認します。この研究で説明したすべての化合物の実験的に決定された化学シフトと分子量については、表1を参照してください。
  9. 精製したTz-PEG7-DOTA溶液を-80°Cの暗所で保存します
    手記：これは、プロシージャーの許容可能な停止ポイントです。完成したTz-PEG7-DOTA前駆体は、これらの条件下で少なくとも1年間安定です。

5. 177Lu Tz-PEG 7-DOTAのラジオラベル

>注意:プロトコルのこのステップには、放射能の取り扱いと操作が含まれます。これらの手順を実行する前に、または放射能に関する他の作業を行う前に、研究者は所属機関の放射線安全部門に相談する必要があります。電離放射線への曝露を最小限に抑えるために、可能な限りの措置を講じてください。

>注:少量の放射性金属を扱う場合、配位部位の結合の干渉を防ぐために、すべてのバッファーに微量金属を含まないことをお勧めします。

  1. 1.7 mLの遠心チューブに、1 M HClのアリコートで調整した0.25 M酢酸アンモニウム緩衝液200 μLをpH 5.5.
    に加えます。 手記：ラベリングに使用する活性が 370 MBq 未満の場合、使用するバッファーの量を 100 μL に減らす必要があります。
  2. 必要な量の [177Lu]LuCl3 を緩衝液に加えます。追加される量は、実験の被験者の数と投与される放射線量によって異なります。精製ステップ中の放射能の潜在的な損失を補うための予防措置として、1〜2回の追加線量の放射能を追加することをお勧めします。
  3. ステップ5.2でDMSO中のTz-PEG7-DOTAを放射性混合物に加えます。Tz-PEG 7-DOTAの量は、テストされる被験者の数によって異なります。このトピックの詳細については、ステップ 6.2.2.2 を参照してください。
  4. 溶液を37°Cで20分間インキュベートします。
  5. 移動相として 50 mM EDTA、pH 5.5 のラジオインスタント薄層クロマトグラフィー(radio-iTLC)を使用して、放射性標識が完了していることを確認します。標識された [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz はベースライン (Rf = 0) に留まり、遊離 [177Lu]Lu3+ は EDTA によって調整され、溶媒フロント Rf = 1.0 と共に移動します (図 1B)。
  6. 定量的な標識が達成されない場合は、配位子を追加して遊離金属を配位させます。または、C18カートリッジを使用して、標識された[177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tzを精製します。使用については、製造元の指示に従ってください。サンプル手順を以下に示します。
    1. 大きなシリンジで5mLのエタノールをカートリッジにゆっくりと通して、カートリッジをプライミングします。次に、5 mLのアセトニトリルを通過させ、次に5 mLの脱イオン(DI)H2Oを通過させます。
    2. ステップ5.3の放射性リガンド溶液を小さなシリンジで汲み上げ、C18カートリッジにゆっくりと注入します。次に、カートリッジを 10 mL の DI H2O で洗浄し、結合していない [177Lu]LuCl3 を除去します。
    3. 500 μLのエタノールで溶出します。乾燥窒素またはアルゴンの低流量で容器を10〜15分間通過することにより、最終製品からエタノールを除去します。その後、放射性リガンドを生理食塩水に、ステップ6.2.2.2で決定した容量で再懸濁します。

6. 生体内研究

>注意:セクション5と同様に、プロトコルのこのステップには放射能の取り扱いと操作が含まれます。これらの手順を実行する前に、研究者は所属機関の放射線安全部門に相談する必要があります。電離放射線への曝露を最小限に抑えるために、可能な限りの措置を講じてください。

  1. 動物の準備
    1. 雌の胸腺ヌードマウスでは、細胞培地とマトリックス(例えば、Matrigel)の1:1混合物の150μLに懸濁した5×106 SW1222結腸直腸癌細胞を皮下移植し、これらを100〜150mmの3異種移植片に成長させます(接種後14〜18日)。
    2. 生体内分布実験のための動物の選別
      1. 腫瘍がキャリパー測定によって決定された十分なサイズになったら、動物を選別して、各コホートの平均腫瘍体積がほぼ同じになるようにします。動物は、消えないインク(1つのバンド、2つのバンドなど)で尾にマーキングすることで、各ケージで区別できます。
    3. 縦断的治療研究のための動物の選別
      1. 腫瘍がキャリパー測定によって決定された十分なサイズになったら、実験全体で正しい追跡を確保するために、各動物に耳タグを取り付けます
        手記：数字の耳タグは、実験中に脱落する可能性があります。その結果、これらの物理タグに体系的な方法(すなわち、右、左、両側、右×2、左×2)で耳のノッチを添付することが推奨される。
    4. 各コホートの平均腫瘍体積がほぼ等しくなるように動物を並べ替えます。以下の動物の選別方法は、表計算ソフトを使用して行うことができます。
      1. 動物の識別番号、耳のノッチパターン、および腫瘍の体積を3つの別々の列にリストします。
      2. 腫瘍体積が小さいものから大きいものへとデータを並べ替えます。
      3. 4列目で、各動物にケージ番号を割り当て、ヘビのようなパターンでケージを循環させます。たとえば、ケージが 5 つある場合、すべての動物にケージが割り当てられるまで、この列は "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." と入力されます。
      4. ケージが割り当てられたら、データをケージ番号でソートします。耳のノッチを使用している場合は、特定のケージ内の各動物に固有の耳のノッチパターンがあることを確認してください。特定のケージに重複(同じパターンが2つ以上)ある場合は、すべてのケージに独自の耳のノッチパターンを持つ動物がいるまで、1つのマウスを欠落しているパターンの別のケージのマウスと交換します。
  2. 製剤と注射剤
    手記：生体内分布と治療の両方の研究のための注射の順序は次のように進行します: huA33-TCO が最初に注入され、次に [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz が事前に決定された間隔の後に注入されます。
    1. 免疫複合体
      1. ステップ 1.9 の huA33-TCO 溶液のアリコートを 0.9% 滅菌生理食塩水で 0.8 mg/mL の濃度に希釈します。
      2. PBS中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)で前処理したシリンジに150μL(100μg)のhuA33-TCO溶液をドローし、これらのシリンジを氷上に保存します
        手記：BSA処理は、抗体のシリンジ壁への非特異的結合を減少させます。
      3. 尾静脈を拡張するために、ヒートランプの下で動物を3分間温めます。
      4. huA33-TCO溶液を異種移植片マウスの尾静脈に注入します。huA33-TCOがマウスの腫瘍に蓄積するまで24時間(または事前に決定された別の時間間隔)を待ちます。
    2. 放射性リガンド
      1. セクション5で概説されているように、放射性標識Tz-PEG 7-DOTA。
      2. 投与されたhuA33-TCOの量と比較して、1.1モル相当のTz-PEG 7-DOTAを含む0.9%滅菌生理食塩水を150μLで用量を引き込みます。例として、100 μg(0.67 nmol)のhuA33-TCOを動物に注入し、[177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz反応混合物を12.4 GBq/μmolの比活性で作製した場合、それぞれ9.14 MBqの活性を含む用量が引き出されます。これは、0.74 nmolのTz(huA33-TCOに対して1.1モル等式)に相当します。
      3. 尾静脈を拡張するために、ヒートランプの下で動物を3分間温めます。
      4. 放射性リガンドの用量を異種移植片マウスの尾静脈に注入します。注入する活性の量は、研究者によって決定されます。公開されたデータは、7.4〜55.5MBqの範囲内の腫瘍サイズに対する用量依存的な治療効果を示しています。

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結果

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図1:(A)[177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tzの放射性標識の概略図。(B)[177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tzの>98%の放射化学的純度を示す代表的なradio-iTLCクロマトグラム。

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
(E)-シクロオクト-4-エニル2,5-ジオキソ-1-ピロリジニルカーボネート(TCO-NHS) シグマ・アルドリッチ764523 -80°Cで保存
2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル5-[4-(1,2,4,5-テトラジン-3-イル)ベンジルアミノ]-5-オキソペンタノエート(Tz-NHS) シグマ・アルドリッチ764701-80°Cで保存
アセトニトリル(MeCN) フィッシャーサイエンティフィックA998年4月
酢酸アンモニウム(NH4OAc) フィッシャーサイエンティフィックA639-500
Boc-PEG7-アミン(O-(2-アミノエチル)-O'-[2-(ボカミノ)エチル]ヘキサエチレングリコール) シグマ・アルドリッチ70023 -20°Cで保存
ジクロロメタン(DCM) フィッシャーサイエンティフィックD143-1
ジメチルスルホキシド(DMSO)、無水 フィッシャーサイエンティフィックD12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 遠心フィルターユニット フィッシャーサイエンティフィックUFC205024
GE Healthcare ディスポーザブル PD-10 脱塩カラム フィッシャーサイエンティフィック45-000-148
N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、無水 フィッシャーサイエンティフィックAC610941000
リン酸緩衝生理食塩水(PBS) フィッシャーサイエンティフィック〒70-011-044 10x コンセントレート
p-SCN-Bn-DOTA マクロサイクリックB-205 -20°Cで保存
トリエチルアミン(TEA) フィッシャーサイエンティフィックAC157911000
トリフルオロ酢酸(TFA) フィッシャーサイエンティフィック A116-50
腫瘍測定装置 ペイラ ペイラTM900

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