循環miRNA抽出:有機抽出と低分子RNA濃縮により血漿サンプルからmiRNAを単離する方法

要約

出典:Canale, M. et al., Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、有機抽出とガラス繊維カラム濃縮を使用して、結腸直腸癌患者の血漿サンプルから循環マイクロRNAを抽出する方法を説明しています。miRNAは血清や血漿などの生体液中で安定しているため、がんの診断、予後、治療の意思決定とモニタリングに理想的な循環バイオマーカーとなっています。この方法は、患者の臨床転帰を予測できる新しい循環バイオマーカーを特定するのに役立ちます。

プロトコル

>注:Good Laboratory Practice(GLP)に従って、滅菌されたヒュームフードの下で次の手順をすべて実行してください。

1. 血漿の収集と保存

1. 末梢血サンプル3mLをK3E EDTAチューブに採取します。
2. チューブを室温で1,880 x gで15分間遠心分離します。
3. 上清血漿を450μLのアリコートで回収します。
4. サンプルは使用まで-80°Cで保存します.
   注:採取から2時間以内に末梢血管を処理します。チューブから血漿を回収するときは、リンパ球層を乱さないでください。

2. 血漿サンプルからの循環miRNAの抽出

1. 必要なすべての溶液を準備し、抽出ステップのためにサンプルを解凍します。
   1. 2x変性溶液に375 μLの2-メルカプトエタノールを加え、よく混合します。
   2. 21 mLのACSグレードの100%エタノールをmiRNA洗浄液Iに加え、よく混合します。
   3. 40 mLのACSグレードの100%エタノールを洗浄液2/3に加え、よく混ぜます。
   4. プラズマアリコートを室温で解凍してから、抽出ステップを開始します。

2. >有機抽出
   1. 400 μLの血漿サンプルをRNaseフリーの2 mLチューブに移します。
   2. 400 μLの2倍変性溶液を加え、ボルテックスで混合し、短時間遠心分離します。
   3. 1 nMのスパイクイン液を4 μL加え、ボルテックスで混合し、短時間遠心分離します。
   4. 800μLの酸性フェノール-クロロホルムを加えます。
   5. 60秒間ボルテックスし、最高速度(≥10,000 x g)で15分間遠心分離します。
   6. 上部水相を新しいチューブに移します。間相を乱さないでください。回収された体積に注意し、非水相を含むチューブを廃棄します。
      手記： 2x変性溶液は4°Cで保存され、この温度で固化する可能性があります。使用前に、溶液を37°Cに温め、時々10〜15分間攪拌します。混合物の上部にある水性緩衝液ではなく、酸性フェノール-クロロホルムを含む底相を抜くように注意してください。溶出液またはヌクレアーゼフリーの水を95°Cに予熱し、適切な量の溶液(サンプルあたり100μL+10%過剰)を加熱するように注意してください。

3. 低分子RNAの濃縮
   1. ステップ2.2.6の水相に1/3容量のエタノールを100%加え、十分に混合します。
   2. 各サンプルの新しい収集チューブにフィルターカートリッジを入れます。
   3. ステップ2.3.1から最大700μLのライセートとエタノールをフィルターカートリッジに移し、10,000 x gで30秒間遠心分離します。
   4. 混合物が>700μL残っている場合は、濾液を新しいチューブに入れ、ステップ2.3.3を繰り返します。混合物全体がフィルターカートリッジを通過するまで繰り返します。
   5. フロースルーの総体積を測定します。
   6. 2/3容量のエタノールを100%加えて濾液化し、十分に混合します。
   7. 2番目のフィルターカートリッジを新しい収集チューブに入れます。
   8. 最大700 μLのサンプル量をカートリッジに移し、10,000 x gで30秒間遠心分離します。
   9. すべての混合物がフィルターカートリッジを通過するまで、手順1.3.8を繰り返します。
   10. 700 μL の miRNA 洗浄液 1 をフィルターカートリッジに適用し、収集チューブでフィルターカートリッジを 10,000 x g で 15 秒間遠心分離します。フィルターカートリッジを同じ収集チューブに入れます。
   11. 500 μLの洗浄液2/3をフィルターカートリッジに塗布し、収集チューブでフィルターカートリッジを10,000 x gで15秒間遠心分離します。フィルターカートリッジを新しい収集チューブに入れます。
   12. フィルターカートリッジを新しい収集チューブに入れ、500μLの洗浄液2/3で手順2.3.11を繰り返します。フロースルーを廃棄し、フィルターカートリッジを新しい収集チューブに移します。
   13. フィルターカートリッジでチューブを10,000 x gで1分間遠心分離します。
   14. フィルターカートリッジを新しい1.5 mLコレクションチューブに移し、100 μLの予熱済み(95 °C)溶出溶液またはヌクレアーゼフリーの水を加えます。
   15. 10,000 x gで30秒間遠心分離してmiRNAを回収し、-80°Cで保存します
       手記：洗浄液中に白い沈殿物が形成されることがあります2/3。この沈殿物は、溶液から放出される過剰なEDTAです。ピペッティングステップ中にこれらの結晶を吸い上げないでください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RnaseフリーのSafe-lock 1.5 mLチューブ	エッペンドルフ	0030 123.328
Rnaseフリー1000μLチップ	スターラブ	S1122-1830
RnaseフリーのSafe-lock 2 mLチューブ	エッペンドルフ	0030 123.344
Rnaseフリーの20 μLチップ	スターラブ	S1123-1810
Rnaseフリーの200 μLチップ	スターラブ	S1120-8810
mirVana PARIS RNA & ネイティブタンパク質精製キット	サーモフィッシャー	AM1556
100%エタノール異動性ACSグレード	Carlo Erba試薬	414605
2-メルカプトエタノール	シグマ・アルドリッチ	M3148
0.2-2、1-10、2-20、20-200、100-1000 μLラボ用ピペット
ヒュームフード
卓上マイクロ遠心分離機
渦動

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