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動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 便からのゲノムDNA単離
>注:市販のキットを利用して、便病原体検出プロトコルに従って便から微生物DNAを分離します。-80°Cの冷凍庫から直接サンプルを取り出し、計量しながらドライアイスで保管します。
- 最大220 mgの便を、1.4 mLの室温(RT)便溶解バッファーを含む清潔なマイクロチューブに移します(材料の表を参照)
。.
- サンプルを1分間ボルテックスして、固体を完全に均質化します(図1B)。懸濁液を95°Cに5分間加熱して、すべての細菌(グラム陽性菌を含む)を溶解します。
- サンプルを15秒間ボルテックスし、その後、20,000 x gで1分間遠心分離して、便固形物をペレット化します。上清を2mLのマイクロチューブに移します。各サンプルに1錠ずつ加えてPCR阻害剤を吸収し、錠剤が溶解するまでボルテックスし、サンプルを室温で1分間インキュベー
トします。
- サンプルを20,000 x gで3分間遠心分離し、上清を新しいマイクロチューブに移します。20,000 x gで3分間遠心分離します。15 μL のプロテイナーゼ K (20 mg/mL ストック) を新しい 1.5 mL マイクロチューブに分注します。サンプル200μLをプロテイナーゼKの入ったチューブにピペットで入れます。
- 200 μLの塩化グアニジン溶解バッファーをチューブに加え、15秒間完全にボルテックスし(材料の表を参照)、サンプルを70°Cで10分間インキュベートします。200 μLのエタノール(96-100%)をチューブに加え、ボルテックスしてよく混合します。
- シリカベースのスピンカラムを2 mLのコレクションチューブに入れ、サンプルをカラムにアプライします。蓋を閉め、20,000 x gで1分間遠心分離します。
- カラムを新しい 2 mL コレクションチューブに移し、500 μL の洗浄バッファー 1 をカラムに加え、カラムをキャップして 20,000 x g で 1 分間遠心分離します。カラムを新しい 2 mL コレクションチューブに移し、500 μL の洗浄バッファー 2 をカラムに加えます。 キャップを閉め、20,000 x gで3分間遠心分離します。
- キャップを閉じた状態で、カラムを新しい 2 mL コレクションチューブに移し、20,000 x g でさらに 1 分間遠心分離して、残留洗浄バッファーを除去します。カラムを標識した1.5 mLのマイクロチューブに移し、EDTAを含む溶出バッファー200 μLをメンブレンに加えてサンプルを溶出します(材料の表を参照)。
- キャップを閉め、室温で1分間インキュベートし、サンプルを20,000 x gで1分間遠心分離し、カラムを廃棄します。
2. PCRのためのDNA濃度測定とサンプル調製
>注:蛍光光度計と市販のdsDNA蛍光アッセイを使用して、各サンプルのゲノムDNA濃度を決定します(材料の表を参照)。蛍光色素は、二本鎖DNAに特異的に結合する必要があります。
- 各サンプルを1:200に希釈し(各サンプル1 μLを199 μL dsDNAマスターミックスに溶解)、標準試料を1:50に希釈します。dsDNA設定を使用して蛍光光度計で分析します。
注:PCR中の大量のDNAは抑制性である可能性があるため、使用されるDNAの量はPCRの最終容量の10%を超えてはなりません。蛍光光度計は、蛍光色素に結合したDNAのみが蛍光を発するため、サンプル中のDNAの正確な測定が可能となり、最終的に計算されたDNA濃度に汚染物質が寄与する可能性を排除します。このレベルの正確な定量は、ダウンストリームのシーケンシングアプリケーションに不可欠です。
- 適切な容量の10 mM Tris、pH 8.5で5 ng/μLに希釈したPCRテンプレートを調製し、各サンプルのワーキングテンプレートストックを作成します。
- サンプルは-20°Cで保存してください。
>3. 16S の望ましい V 領域へのプライマーを設計する
- 目的のV 16S rRNA領域を選択的に増幅するためのプライマーを設計します。
- Ribosomal Database ProjectのProbe Matchを使用してプライマーを分析し、さまざまな門のおおよそのヒット率を決定します
注:V1-V3領域については、現在の研究では、V1領域内の位置8で結合する公開プライマーBosshardフォワードと、V3領域内の位置533で結合する533リバースを使用しました。プライマーには、インデックス作成用のオーバーハングアダプター配列が含まれている必要があります。
- プライマーを設計する際には、16Sメタゲノミクスシーケンシングライブラリ調製で推奨されているように、各プライマーの5'末端にアダプター配列を含めます(表1)。
- これらの大型プライマーをカートリッジ精製で合成します。乾燥させたプライマーを再構成し、PCRワーキングストックを10 mM Tris、pH 8.5で1 μMに希釈します。
4. オーバーハングアダプター配列が付着したV領域を増幅するAmplicon PCR
- アンプリコンPCR反応ミックスを表2の説明に従ってセットアップします。
- プレート上に粘着性の透明なPCRプレートシールを貼り、表3のパラメータを使用してアンプリコンPCRを実行します。
- (オプション)アガロースゲルまたはアンプリコンサイズの定量的測定を可能にする高感度DNAアッセイでアンプリコンPCR産物を実行します(材料表を参照).
注:この試験のアンプリコンサイズは550 bpです(図2a)。
>5. 磁気ビーズを用いたPCRクリーンアップ
- アンプリコンPCRプレートを1,000 x gで1分間迅速に遠心分離し、縮合を収集します
手記：PCRプレートの代わりにPCRチューブストリップを使用することで、コンタミネーションを最小限に抑えることができます。チューブの蓋は廃棄し、絶対に再利用しないでください。
- 磁気ビーズをボルテックスして均一に分散させ、各アンプリコンPCRウェルに20μLの磁気ビーズを加えてから、全容量をゆっくりと10回上下させます。
- 室温で5分間インキュベートし、PCRプレートを磁気スタンドに2分間置き、磁気ビーズが収集され、上清が透明になるまで待ちます。上清を取り除き、廃棄します。
- PCRプレートを磁気スタンドに置いた状態で、ビーズを200 μLの新鮮な80%エタノールで洗浄し、磁気スタンドのRTで30秒間インキュベートします。上清を慎重に取り除きます。
- もう一度洗濯を繰り返します。次に、細いピペットチップを使用してウェルから残留エタノールを取り除き、10分間風乾させます。
- PCRプレートをマグネティックスタンドから取り出し、52.5 μLの10 mM Tris pH 8.5を各ウェルに加えます。ピペットで10回上下させてビーズを懸濁し、室温で2分間インキュベートします。
- PCRプレートを磁気スタンドに移して磁気ビーズを収集し、上清50μLをきれいなPCRプレートに移します。粘着性の透明なPCRプレートシールをプレートに貼り、-20°Cで最大1週間保存します。
| Amplicon PCRプライマー |
| フォワード | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGagagtttgatcMtggctcag-3' |
| 逆 | 5'- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTACCGCGGCTGCTGGCAC -3' |
| 遺伝子座固有の配列は太字で示され、太字でない配列はオーバーハングアダプターの配列です。 |
表1:Amplicon PCRプライマー。
| Amplicon PCR反応のセットアップ | |
| 容積 |
| 微生物DNA (5ng/μl) | 2.5 μl |
| フォワードプライマー(1 μM;ステップ3.1から) | 5.0 μl |
| リバースプライマー(1 μM、ステップ3.1から) | 5.0 μl |
| 2X HotStartレディミックス | 12.5 μl |
| トータル | 25.0μl |
表2:Amplicon PCRプライマー。
| >Amplicon PCRのセットアップ |
| 95°Cで3分間 | |
| 25サイクル: | |
| 95°Cで30秒間 |
| 55°Cで30秒間 |
| 72°Cで60秒間 |
| 72°Cで3分間 | |
| 4°Cで保持します | |
表3:Amplicon PCRプログラムのセットアップ。
