糞便微生物DNA単離:マウス腫瘍モデルにおける環境濃縮がマイクロバイオームの多様性に及ぼす影響の研究

要約

出典:Fuller, A. K, et al. A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、結腸腫瘍担存マウスの糞便サンプルからのDNA分離プロトコルについて説明しています。抽出したDNAをPCRで増幅し、磁気ビーズベースのアプローチでさらに洗浄します。この方法は、環境濃縮が結腸微生物叢と動物の死亡率に及ぼす影響を判断するために使用できます。

プロトコル

動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 便からのゲノムDNA単離

>注:市販のキットを利用して、便病原体検出プロトコルに従って便から微生物DNAを分離します。-80°Cの冷凍庫から直接サンプルを取り出し、計量しながらドライアイスで保管します。

1. 最大220 mgの便を、1.4 mLの室温(RT)便溶解バッファーを含む清潔なマイクロチューブに移します(材料の表を参照)
。.
2. サンプルを1分間ボルテックスして、固体を完全に均質化します(図1B)。懸濁液を95°Cに5分間加熱して、すべての細菌(グラム陽性菌を含む)を溶解します。
3. サンプルを15秒間ボルテックスし、その後、20,000 x gで1分間遠心分離して、便固形物をペレット化します。上清を2mLのマイクロチューブに移します。各サンプルに1錠ずつ加えてPCR阻害剤を吸収し、錠剤が溶解するまでボルテックスし、サンプルを室温で1分間インキュベー
トします。
4. サンプルを20,000 x gで3分間遠心分離し、上清を新しいマイクロチューブに移します。20,000 x gで3分間遠心分離します。15 μL のプロテイナーゼ K (20 mg/mL ストック) を新しい 1.5 mL マイクロチューブに分注します。サンプル200μLをプロテイナーゼKの入ったチューブにピペットで入れます。
5. 200 μLの塩化グアニジン溶解バッファーをチューブに加え、15秒間完全にボルテックスし(材料の表を参照)、サンプルを70°Cで10分間インキュベートします。200 μLのエタノール(96-100%)をチューブに加え、ボルテックスしてよく混合します。
6. シリカベースのスピンカラムを2 mLのコレクションチューブに入れ、サンプルをカラムにアプライします。蓋を閉め、20,000 x gで1分間遠心分離します。
7. カラムを新しい 2 mL コレクションチューブに移し、500 μL の洗浄バッファー 1 をカラムに加え、カラムをキャップして 20,000 x g で 1 分間遠心分離します。カラムを新しい 2 mL コレクションチューブに移し、500 μL の洗浄バッファー 2 をカラムに加えます。 キャップを閉め、20,000 x gで3分間遠心分離します。
8. キャップを閉じた状態で、カラムを新しい 2 mL コレクションチューブに移し、20,000 x g でさらに 1 分間遠心分離して、残留洗浄バッファーを除去します。カラムを標識した1.5 mLのマイクロチューブに移し、EDTAを含む溶出バッファー200 μLをメンブレンに加えてサンプルを溶出します(材料の表を参照)。
9. キャップを閉め、室温で1分間インキュベートし、サンプルを20,000 x gで1分間遠心分離し、カラムを廃棄します。

2. PCRのためのDNA濃度測定とサンプル調製

>注:蛍光光度計と市販のdsDNA蛍光アッセイを使用して、各サンプルのゲノムDNA濃度を決定します(材料の表を参照)。蛍光色素は、二本鎖DNAに特異的に結合する必要があります。

1. 各サンプルを1:200に希釈し(各サンプル1 μLを199 μL dsDNAマスターミックスに溶解)、標準試料を1:50に希釈します。dsDNA設定を使用して蛍光光度計で分析します。
   注:PCR中の大量のDNAは抑制性である可能性があるため、使用されるDNAの量はPCRの最終容量の10%を超えてはなりません。蛍光光度計は、蛍光色素に結合したDNAのみが蛍光を発するため、サンプル中のDNAの正確な測定が可能となり、最終的に計算されたDNA濃度に汚染物質が寄与する可能性を排除します。このレベルの正確な定量は、ダウンストリームのシーケンシングアプリケーションに不可欠です。
2. 適切な容量の10 mM Tris、pH 8.5で5 ng/μLに希釈したPCRテンプレートを調製し、各サンプルのワーキングテンプレートストックを作成します。
3. サンプルは-20°Cで保存してください。

>3. 16S の望ましい V 領域へのプライマーを設計する

1. 目的のV 16S rRNA領域を選択的に増幅するためのプライマーを設計します。
2. Ribosomal Database ProjectのProbe Matchを使用してプライマーを分析し、さまざまな門のおおよそのヒット率を決定します
   注:V1-V3領域については、現在の研究では、V1領域内の位置8で結合する公開プライマーBosshardフォワードと、V3領域内の位置533で結合する533リバースを使用しました。プライマーには、インデックス作成用のオーバーハングアダプター配列が含まれている必要があります。
3. プライマーを設計する際には、16Sメタゲノミクスシーケンシングライブラリ調製で推奨されているように、各プライマーの5'末端にアダプター配列を含めます(表1)。
4. これらの大型プライマーをカートリッジ精製で合成します。乾燥させたプライマーを再構成し、PCRワーキングストックを10 mM Tris、pH 8.5で1 μMに希釈します。

4. オーバーハングアダプター配列が付着したV領域を増幅するAmplicon PCR

1. アンプリコンPCR反応ミックスを表2の説明に従ってセットアップします。
2. プレート上に粘着性の透明なPCRプレートシールを貼り、表3のパラメータを使用してアンプリコンPCRを実行します。
3. (オプション)アガロースゲルまたはアンプリコンサイズの定量的測定を可能にする高感度DNAアッセイでアンプリコンPCR産物を実行します(材料表を参照).
   注:この試験のアンプリコンサイズは550 bpです(図2a)。

>5. 磁気ビーズを用いたPCRクリーンアップ

1. アンプリコンPCRプレートを1,000 x gで1分間迅速に遠心分離し、縮合を収集します
   手記：PCRプレートの代わりにPCRチューブストリップを使用することで、コンタミネーションを最小限に抑えることができます。チューブの蓋は廃棄し、絶対に再利用しないでください。
2. 磁気ビーズをボルテックスして均一に分散させ、各アンプリコンPCRウェルに20μLの磁気ビーズを加えてから、全容量をゆっくりと10回上下させます。
3. 室温で5分間インキュベートし、PCRプレートを磁気スタンドに2分間置き、磁気ビーズが収集され、上清が透明になるまで待ちます。上清を取り除き、廃棄します。
4. PCRプレートを磁気スタンドに置いた状態で、ビーズを200 μLの新鮮な80%エタノールで洗浄し、磁気スタンドのRTで30秒間インキュベートします。上清を慎重に取り除きます。
5. もう一度洗濯を繰り返します。次に、細いピペットチップを使用してウェルから残留エタノールを取り除き、10分間風乾させます。
6. PCRプレートをマグネティックスタンドから取り出し、52.5 μLの10 mM Tris pH 8.5を各ウェルに加えます。ピペットで10回上下させてビーズを懸濁し、室温で2分間インキュベートします。
7. PCRプレートを磁気スタンドに移して磁気ビーズを収集し、上清50μLをきれいなPCRプレートに移します。粘着性の透明なPCRプレートシールをプレートに貼り、-20°Cで最大1週間保存します。

Amplicon PCRプライマー
フォワード	5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGagagtttgatcMtggctcag-3'
逆	5'- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTACCGCGGCTGCTGGCAC -3'
遺伝子座固有の配列は太字で示され、太字でない配列はオーバーハングアダプターの配列です。

表1:Amplicon PCRプライマー。

Amplicon PCR反応のセットアップ
	容積
微生物DNA (5ng/μl)	2.5 μl
フォワードプライマー(1 μM;ステップ3.1から)	5.0 μl
リバースプライマー(1 μM、ステップ3.1から)	5.0 μl
2X HotStartレディミックス	12.5 μl
トータル	25.0μl

表2:Amplicon PCRプライマー。

>Amplicon PCRのセットアップ
95°Cで3分間
25サイクル:
	95°Cで30秒間
	55°Cで30秒間
	72°Cで60秒間
72°Cで3分間
4°Cで保持します

表3:Amplicon PCRプログラムのセットアップ。

結果

図1:EEおよびNEのハウジング条件と便のホモジネート(プロトコルに記載されている)

図2:16Sマイクロバイオームライブラリの準備。(A)便ゲノムDNAに由来する未精製PCRアンプリコン産物。(B)使用するソフトウェアに従って設計されたインデックスプレートのグラフィック(資料の表)。デュアルインデックスの組み合わせ、I7(インデックス1;行) と I5 (インデックス 2;Column) がサンプルごとに表示されます。各インデックスの長さは 8 bp...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mLマイクロチューブ - RNAseおよびDNAseフリー	任意のサプライヤー
QIAamp DNAスツールミニキット	キアゲン	51504	このキットは、50種類のDNA調製物用の試薬を提供します。便溶解バッファー=ASL;塩化グアニジニウム溶解バッファー= AL;緩衝液1を塩化グアニジン= AW1で洗浄します。ウォッシュバッファー2 = AW2;EDTA=AEの溶出バッファー
ウォーターバス(95まで加熱可能)	任意のサプライヤー		糞便サンプルを94度インキュベートして細胞を溶解します。
ウォーターバス(70度まで加熱可能)	任意のサプライヤー		便サンプルの70度インキュベーション用
エタノール(200プルーフ)	シグマ・アルドリッチ	E7023
Qubit dsDNA ブロードレンジアッセイキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	質問32850
EBバッファーまたは10 mMトリスpH 8.5	キアゲン	19086
実験用プライマー	任意のサプライヤー
PCRグレードの水	任意のサプライヤー
2X KAPA HiFi HotStartレディミックス	カパバイオシステムズ	KK2601	アンプリコン増幅用(1.25 mLで100 rxns可能)。
診断用ゲルのランニング用アガロース	任意のサプライヤー
プロテイナーゼK (600 mAU/ml)	キアゲン	19131	20 mg/mLのプロテイナーゼKに相当 QiaAmpキット付属
アジャンクール アンプレ XP マグネティックビーズ	ベックマン・コールター	A63880 (英語)	PCRクリーンアップ用のマゼンティックビーズ5mLは250のPCR反応をクリーニングします
マグネットスタンド	ライフテクノロジー	AM10027
蛍光光度計:キュービット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	質問33216
ライブラリ準備ガイド	イルミナ		16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/ content/dam/illumina-support/ documents/documentation/ chemistry_documentation/16s/16s/metagenomic-library-prep guide-15044223-b.pdf.
MicroAmp Optical 96ウェル反応プレート	アプライドバイオシステムズ/サーモフィッシャー
粘着性クリアプレートシール	アプライドバイオシステムズ/サーモフィッシャー	4360954	Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp 粘着フィルム

年 名