CRCオルガノイド細胞の標識:GFPレンチウイルス形質導入結腸直腸癌オルガノイド細胞を生成する方法

要約

出典:岡澤Y. et al., High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor. J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、蛍光イメージングを可能にするために、GFPレンチウイルス粒子によって形質導入されたCRCオルガノイドを生成する技術について説明しています。これらのGFP標識オルガノイドを動物モデルに添加すると、腫瘍の浸潤と転移の研究に役立ちます。

プロトコル

1. 人工細胞外マトリックス上で培養したCRCオルガノイドの作製

結腸PDXのCRCオルガノイド培養の実験手順を図1B(ステップ4)に示します。

1. PDX由来のCRCオルガノイドに適した培地(Table of Materialsの「CRCオルガノイド培養培地」を参照)を、ヒト結腸オルガノイドについて前述した培地を用いて樹立する。
2. 1ウェルあたり150 μLの人工細胞外マトリックス(材料の表を参照)を氷上の12ウェルプレートにアプスし、37°C、5%_CO2インキュベーターで30〜60分間インキュベートしてゲルを固化させます。
3. PDXマウスモデルから得られたCRC細胞の細胞ペレットを、5% FCSを含むCRCオルガノイド培地(ステップ1.1から)で懸濁し、3 x 10⁵細胞/mLに調整します。次に、ステップ1.2で調製した人工細胞外マトリックスコーティングプレートに培地1 mLを播種し、5% CO₂の下で37°Cで一晩インキュベートします。細胞懸濁液中の単一細胞および多細胞クラスター(接着細胞のグループ)を含む腫瘍細胞の数をカウントするために、血球計算盤を使用します.
   注:この研究では、コラゲナーゼの残留酵素活性を消光するために5%FCSが使用されます。
4. 人工細胞外マトリックスコーティングプレートから剥離した浮遊細胞を含む培地を翌日、1.5 mLの遠心チューブに慎重に集め、1,400 x gで5分間遠心分離します。次に、上清を取り除き、ペレットを氷上の人工細胞外マトリックス70μLに再懸濁します。
5. CRC細胞の生存率を高めるには、人工細胞外マトリックスコーティングプレートに付着した腫瘍オルガノイド細胞に腫瘍細胞を含む人工細胞外マトリックスを重ね合わせ、37°C、5%_CO2インキュベーターで30分間インキュベートし、人工細胞外マトリックスコーティングを固めます。次に、1% FCSを含む1 mLのCRCオルガノイド細胞培養培地と、5% CO₂ 下で 37 °C でインキュベー
トします。
6. 培地は隔日交換してください。CRCオルガノイドが培地を満たすと、培地を毎日交換する必要が生じる場合があります。

>2. GFPレンチウイルス粒子の生成と濃縮

GFPレンチウイルス粒子の生成と濃縮の実験手順を図1C(ステップ5)に示します。

1. 10% FCSを含むロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640培地でHEK293T細胞を培養し、次のトランスフェクション手順のために6つの10 cmディッシュ(ディッシュあたり2 x 10⁶細胞)を調製します。
2. ディッシュあたりのトランスフェクションには、DMEM中のトランスフェクション試薬20 μLを含む混合物500 μLを、PRRL-GFPベクター(5 μg)およびpCMV-VSV-G(1 μg)およびpCMV-dR8.2 dvpr(5 μg)などの2つのレンチウイルスパッケージングプラスミドとともに、滅菌済みの1.5 mLマイクロチューブに調製します。室温で20分間保持した後、10cmの皿に重ねて18時間インキュベー
トします。
3. 培地を取り出し、新鮮な10% FCS-RPMI 1640培地を5 mL各皿に加え、24時間放置します。
4. 各ディッシュから馴染ませた培地を50 mLの遠心チューブに集め、合計30 mLの培地を4°Cで一晩保存します。新鮮なRPMI 1640を5mL各皿に加え、24時間放置します。
5. 各ディッシュからコンディショニングされた培地を50 mLの遠心分離チューブに集め、合計30 mLの培地を氷上に保ちます。次に、セルを破棄します。
6. 0.45 μmフィルターで培地60 mL(ステップ2.4-2.5)をろ過して細胞を除去し、この量を12本の5 mLポリプロピレン遠心チューブに分割して超遠心分離します。
7. ウイルスを濃縮するには、スイングバケットローターを使用して、85,327 x gで4°Cで1.5時間
遠心分離します。
8. すぐにメディアを取り出します。濃縮ウイルスペレットを分離するには、250 μLの栄養ハム混合物F-12(F12)/FCSを含まないDMEM培地を12本のチューブのそれぞれに入れ、4°Cで一晩維持します。ウイルスペレットは見えないことが多いことに注意してください。
9. 培地を静かにピペットで動かして、濃縮された5x GFPレンチウイルスストックを合計3 mL(おそらくGFPレンチウイルス粒子を含む)1mLあたり10⁸形質導入単位(TU / mL)で回収します。次に、12本の1.5 mLマイクロチューブ(チューブあたり250 μLを含む)を-80°Cの滅菌条件下で最長1年間保存します。元の溶液の小さなアリコートを多数調製して、複数回の凍結融解サイクルを回避します。

>3. 人工細胞外マトリックス上で培養したGFPレンチウイルス粒子によるCRCオルガノイド細胞の標識

CRCオルガノイド細胞をGFPレンチウイルスで標識する実験手順を図1C(ステップ6)に示します。

1. ステップ1.6で調製したCRCオルガノイドを7〜10日間干渉なく増殖させ、滅菌細胞スクレーパーを使用して機械的に回収し、1.5 mLのマイクロチューブに移します
   手記：培養中のCRCオルガノイドの増殖は、患者由来の元の腫瘍の性質によって異なります。CRCオルガノイドを60-70%のコンフルエンスに維持してから、1:2の分割比で新しい人工細胞外マトリックスでコーティングされた12ウェルプレートに移すことで、CRCオルガノイドの過成長を回避します。
2. マイクロチューブを1,400 x gで3分間遠心分離し、培地を取り出し、500 μLのPBS中で細胞ペレットを穏やかにタッピングして分離します。
3. マイクロチューブを1,400 x gで3分間遠心分離し、PBSを除去します。
4. 付着したCRCオルガノイドを解離するには、チューブ内の細胞ペレットにタンパク質分解酵素とコラーゲン分解酵素の細胞剥離溶液500μLを加え、軽くたたいて混合します。その後、チューブを室温で10分間静置します。
5. 1.5 mLマイクロチューブに500 μLの1% FCS-DMEMを数回加えて、細胞懸濁液を非常に穏やかにピペットで動かし、細胞を大まかに解離します。過酷なピペッティングによるCRCオルガノイドからの単一細胞の生成は、細胞生存率を著しく低下させます。したがって、細胞懸濁液中で細胞の塊を視覚的に検出可能なままにしておくために、1.5 mLのマイクロチューブで静かにピペッティングすることが不可欠です。
6. 細胞懸濁液を1,400 x gで3分間遠心分離し、上清を除去します。
7. 1.5 mL マイクロチューブに 5x GFP レンチウイルスストック 100 μL (>10⁸ TU/mL) と 400 μL の CRC オルガノイド培養培地を混合し、穏やかにタッピングして 500 μL あたり⁵ x 10 5 解離腫瘍細胞の濃度に調整し、細胞ペレットを分離します。腫瘍細胞の数をカウントするには、血球計算盤を使用します。 上記のように、細胞懸濁液中に単一細胞および細胞群を含める(ステップ1.3)。
8. ステップ1.2で説明したように、人工の細胞外マトリックスでコーティングされた12ウェルプレートを調製します。次に、ステップ3.7で調製した細胞懸濁液500μLをプレート上に置き、5%_CO2の下で37°Cで18時間放置します。
9. 浮遊細胞を人工細胞外マトリックスコーティングプレートから分離した培地を1.5 mLの遠心分離チューブに集めます。1,400 x gで遠心分離し、上清を取り除き、ペレットを氷上の人工細胞外マトリックス70 μLに再懸濁します。
10. CRC細胞の生存率を高めるには、ステップ1.5で説明したように、人工細胞外マトリックスでコーティングされた12ウェルプレートに付着した腫瘍オルガノイドに、腫瘍細胞を含む人工細胞外マトリックスを重ね合わせます。次に、プレートを37°C、5%_CO2インキュベーターで30分間インキュベートして人工細胞外マトリックスコーティングを固化させ、1%FCSを含む1 mLのCRCオルガノイド培養培地で37°C、5%_CO2未満で培養します。
11. 感染後3日目に蛍光顕微鏡で細胞を観察し、高力価のレンチウイルス粒子を使用したことによるGFP陽性がほぼ100%であることを確認します(図2Aを参照)。
12. CRCオルガノイドを7〜10日間培養して細胞増殖を拡大してから、レシピエントマウスに注入します。

結果

図1:NOGマウスにおけるGFPレンチウイルスで標識されたPDX由来CRCオルガノイドによる転移の生成の概略図。(A)NOGマウスへのCRC組織の小片の皮下移植(ステップ1)。患者から外科的に解剖されたCRC組織を断片に切断し、NOGマウスに皮下移植しました。(B) PDXから解離したCRCオルガノイドの生成(ステップ2–4)。開発したCRC異種移植片をミンチ化し(ステップ2)、コラゲナーゼを含む培地を含む15mLのチューブに移しました(ステップ3)。ゆっくりと撹拌しながらインキュベートした後、CRC細胞懸濁液をろ過しました(ステップ3)。次に、CRCオルガノイド培地中のオルガノイド細胞懸濁液を人工細胞外マトリックスコーティングプレートに播種し、_CO2インキュベーターで一晩インキュベ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
12ウェルプレート	BMビオ	#92412
マイクロチューブ	エッペンドルフ	#0030120086	使用前のオートクレーブ
血球計算盤	アーマ	#03-202-1
マトリゲル基底膜マトリックス	コーニング	#354234	アリコートは-20°Cで保存し、使用するまで氷の上に置いてください
コラゲナーゼ1型	シグマ	#C1030	150 mg/mL コラゲナーゼ 1 型 1 を 1×PBS に溶解します。アリコートを-20°Cで最大1年間保存
DMEM/F-12 と GlutaMAX™	ギブコ	#10565018
ペニシリン	ギブコ	#15140122	4°Cで保存し、1か月以内に使用してください
hEGFの	ペプロテック	#AF-100-15	-20°Cで保存し、使用日と同日に培地に加えます
Y27632、ROCK阻害剤	和光	#253-00591	-20°Cで保存し、使用日と同日に培地に加えます
ストレプトマイシン	ギブコ	#15140122	4°Cで保存し、1か月以内に使用してください
1%または5%FCSを含むCRCオルガノイド培地			DMEM/F-12 と GlutaMAX™ サプリメント (Gibco #10565018) に 1% または 5% FCS、100 U/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン、2 ng/ml hEGF、および 10 μM Y27632 (ROCK 阻害剤) を添加。4°Cで保存し、1ヶ月以内にご使用ください。
PRRL-GFPベクトル	ロバート・A・ワインバーグ博士からの贈り物
FuGENE 6トランスフェクションリージェント	ロシュ	11814 443001
pCMV-VSV-Gの	ロバート・A・ワインバーグ博士からの贈り物
pCMV-dR8.2 dvpr	ロバート・A・ワインバーグ博士からの贈り物
Zeiss Axioplan 2実体蛍光顕微鏡	ツァイス

します